Mikrotensiometer for konfektmikroskopivisualisering av dynamiske grensesnitt

Summary

Dette manuskriptet beskriver utformingen og driften av et mikrotensiometer/konfokalt mikroskop for å gjøre samtidige målinger av interfacial spenning og overflatedilatasjonsreologi mens man visualiserer interfacial morfologi. Dette gir sanntidskonstruksjon av struktur-eiendomsrelasjoner av grensesnitt som er viktige i teknologi og fysiologi.

Abstract

Adsorpsjon av overflateaktive molekyler til væskevæskegrensesnitt er allestedsnærværende i naturen. Karakterisering av disse grensesnittene krever måling av overflateaktive adsorpsjonshastigheter, evaluering av likevektsoverflatespenninger som en funksjon av bulk overflateaktiv konsentrasjon, og relatert til hvordan overflatespenningen endres med endringer i det interfaciale området etter likevekt. Samtidig visualisering av grensesnittet ved hjelp av fluorescensavbildning med et høyhastighets konfokalt mikroskop tillater direkte evaluering av strukturfunksjonsrelasjoner. I det kapillære trykkmikrotensiometeret (CPM) festes en halvkuleformet luftboble på slutten av kapillæren i et flytende reservoar på 1 ml volum. Det kapillære trykket over boblegrensesnittet styres via en kommersiell mikrofluid strømningsregulator som muliggjør modellbasert trykk, boblekurvatur eller bobleområdekontroll basert på Laplace-ligningen. Sammenlignet med tidligere teknikker som Langmuir trough og anhengsfall, er måle- og kontrollpresisjons- og responstiden sterkt forbedret; kapillære trykkvariasjoner kan påføres og kontrolleres i millisekunder. Den dynamiske responsen til boblegrensesnittet visualiseres via en annen optisk linse når boblen utvides og trekker seg sammen. Boblekonturen passer til en sirkulær profil for å bestemme boblekurvaturradiusen, R, samt eventuelle avvik fra sirkularitet som vil ugyldiggjøre resultatene. Laplace-ligningen brukes til å bestemme grensesnittets dynamiske overflatespenning. Etter likevekt kan små trykkoscillasjoner pålegges av den datastyrte mikrofluidiske pumpen for å svinge bobleradiusen (frekvenser på 0,001-100 sykluser/min) for å bestemme dilatasjonsmodulus De overordnede dimensjonene til systemet er tilstrekkelig små til at mikrotensiometeret passer under linsen til et høyhastighets konfokalt mikroskop som gjør det mulig å spore fluorescerende merkede kjemiske arter kvantitativt med submikron lateral oppløsning.

Introduction

Luftvannsgrensesnitt dekket av overflateaktive filmer er allestedsnærværende i hverdagen. Overflateaktive vanninjeksjoner brukes til å øke oljeutvinningen fra utarmede felt og brukes som hydrauliske oppsprekkingsløsninger for skifergass og olje. Gass-væske skum og væske-væske emulsjoner er felles for mange industrielle og vitenskapelige prosesser som smøremidler og rengjøringsmidler og er vanlige i mat. Overflateaktive stoffer og proteiner ved grensesnitt stabiliserer antistoffkonformasjoner under emballasje, lagring og administrasjon 1,2,3,4,5, tårefilmstabilitet i øyet ^6,7,8, og lungemekanikk 9,10,11,12,13,14, ¹⁵.

Studien av overflateaktive agenter eller overflateaktive midler adsorbing til grensesnitt og deres egenskaper har en lang historie med mange forskjellige eksperimentelle teknikker 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . En nylig utvikling er det kapillære trykkmikrotensiometeret (CPM), som tillater undersøkelse av interfaciale egenskaper på svært buede grensesnitt, i mye mindre lengdeskalaer, samtidig som det bruker betydelig færre materialer enn andre vanlige metoder 9,23,24,25. Confocal fluorescence mikroskopi (CFM) kan brukes til å studere morfologien til lipider og proteiner ved luft-vann grensesnitt i CPM²² eller på Langmuir troughs 20,26,27,28,29. Her er en CPM og CFM kombinert for å koble morfologiske fenomener til dynamiske og likevektsinterfaciale egenskaper for å utvikle strukturfunksjonsrelasjoner for biologiske og teknologiske grensesnitt.

Det er mange parametere av betydning i interfaciale overflateaktive systemer som er tilgjengelige for CPM-CFM. I CPM er en luftboble med en diameter på 30-200 μm festet til spissen av et glasskapillært rør. I tidligere versjoner av CPM ble kapillærtrykkforskjellen mellom innsiden og utsiden av boblen kontrollert via en vannsøyle og oscillatorisk sprøytepumpe ^9,30 ; Den nye versjonen som er beskrevet her, erstatter disse med en datastyrt mikrofluidpumpe med høyere presisjon. Overflatespenningen (γ) bestemmes via Laplace-ligningen, ΔP = 2γ/R, fra trykkfallet over grensesnittet som er satt av pumpen, ΔP og optisk analyse av krumningsradiusen til boblen, R. Den dynamiske overflatespenningen til grensesnittet kan bestemmes med 10 ms tidsoppløsning etter generering av en ny boble i kontakt med en bulkvæske som inneholder et løselig overflateaktivt middel. Den overflateaktive adsorpsjonsdynamikken kan beskrives av den klassiske Ward-Tordai-ligningen^10,31 for å bestemme essensielle egenskaper til overflateaktivaet, inkludert diffusivitet, overflatedekning og forholdet mellom bulkkonsentrasjon og likevektsoverflatespenning. Når en likevektsoverflatespenning er oppnådd, kan det interfaciale området oscilleres for å måle dilatasjonsmodulen, , ved å registrere endringene i overflatespenning, indusert av små endringer i bobleoverflateområdet, A³². For mer komplekse grensesnitt som utvikler sine egne indre strukturer som viklet polymerer eller proteiner, er overflatespenningen erstattet av en mer generell overflatespenning ^4,33, .

Lungestabilitet under pusten kan være direkte knyttet til å opprettholde både en lav overflatespenning og en høy dilatasjonsmodul ved alveolar luftvæskegrensesnitt ^9,10. Alle indre lungeflater er foret med en kontinuerlig, mikron-tykk film av epitelforingsvæske for å opprettholde vevshydrering³⁴. Denne epitelforingsvæsken er hovedsakelig vann, med salter og forskjellige andre proteiner, enzymer, sukker og lungeoveraktivt middel. Som det er tilfelle for et buet væskedampgrensesnitt, blir et kapillærtrykk indusert med trykket høyere på innsiden av alveolus (eller boblen). Men hvis overflatespenningen var konstant overalt i lungene, viser Laplace-ligningen, ΔP = 2γ/R, at mindre alveoli ville ha et høyere internt trykk i forhold til større alveoler, noe som tvinger gassinnholdet i den mindre alveolene til å strømme til større alveoler med lavere trykk. Dette er kjent som “Laplace Instability”^9,35. Nettoresultatet er at den minste alveolen ville kollapse og bli fylt med væske og bli vanskelig å blåse opp igjen, noe som fikk en del av lungen til å kollapse, og andre deler ville overoppblåses, som begge er typiske symptomer på akutt respiratorisk nødsyndrom (ARDS). Men i en riktig fungerende lunge endres overflatespenningen dynamisk etter hvert som luftepitelvæskegrensesnittet i alveolus interfacialområdet utvides og trekkes sammen under pusten. Hvis, eller , Laplace-trykket reduseres med synkende radius og øker med økende radius for å eliminere Laplace-ustabiliteten, og dermed stabilisere lungen⁹. Derfor , og hvordan det avhenger av frekvens, monolayer morfologi og sammensetning, og alveolarvæskesammensetning kan være avgjørende for lungestabilitet. CPM-CFM har også gitt de første demonstrasjonene av effekten av interfacial krumning på overflateaktiv adsorpsjon²⁵, monolayer morfologi²² og dilatasjonsmodulus⁹. Det lille volumet (~1 ml) av reservoaret i CPM muliggjør rask innføring, fjerning eller utveksling av væskefasen og minimerer den nødvendige mengden dyre proteiner eller overflateaktive stoffer¹⁰.

Kontrast i et CPM-CFM-bilde skyldes distribusjon av små brøkdeler av fluorescerende merkede lipider eller proteiner ved grensesnittet^16,27. Todimensjonale overflateaktive monolayers viser ofte lateral faseseparasjon som en funksjon av overflatespenning eller overflatetrykk, π er forskjellen mellom overflatespenningen til et rent væskevæskegrensesnitt, γ₀, og et overflateaktivt dekket grensesnitt, γ. π kan tenkes som 2D-trykket forårsaket av samspillet mellom overflateaktive molekyler ved grensesnittet som virker for å senke den rene væskeoverflaten. Ved lavt overflatetrykk er lipidmonolayers i en væskelignende uorganisert tilstand; Dette er kjent som den væskeutvidede (LE) fasen. Etter hvert som overflatetrykket øker og området per lipidmolekyl reduseres, orienterer lipidene seg med hverandre og kan gjennomgå en første ordrefaseovergang til den langtrekkende bestilte væskekondenserte (LC) fase 16,20,27. LE- og LC-fasene kan eksistere sammen ved ulike overflatetrykk og kan visualiseres ettersom fluorescerende merkede lipider er utelukket fra LC-fasen og segregate til LE-fasen. Dermed er LE-fasen lys og LC-fasen er mørk når den er avbildet med CFM¹⁶.

Målet med dette manuskriptet er å beskrive trinnene som er nødvendige for å bygge og betjene det kombinerte konfiske mikroskopmikrotensiometeret. Dette vil tillate leseren å utføre adsorpsjonsstudier, måle overflatespenning, reologisk oppførsel og undersøke interfacial morfologi samtidig på et mikronskala luft / vann eller olje / vann grensesnitt. Dette inkluderer en diskusjon om hvordan du trekker, kutter og hydrofoberer de nødvendige kapillærene, instruksjoner for bruk av trykk, krumning og kontrollmodus for overflateareal, og interfacial overføring av uoppløselig overflateaktivt middel til det mikrotensiometer buede grensesnittet.

Protocol

1. Tilberedning av kapillærrør Plasser kapillæren i en kapillærtrekker og kjør ønsket trekkprogram for å lage to koniske kapillærer med en utvendig diameter (OD) på ~ 1 μm på spissen.MERK: OD på kapillæren før trekking må være OD som er angitt for å passe inn i kapillærholderen i mikrotensiometercellen. Kapillærens indre diameter (ID) kan variere, men vil påvirke den kritiske radiusen til kapillæren etter trekking. Et trekkprogram er valgt slik at den resulterende konen…

Representative Results

En viktig målekilde oppstår fra kapillærene som har feil enten fra skjæreprosessen (figur 5A,B) eller beleggprosessen (figur 5D). Begge typer feil fører til feil i å bestemme bobleformen og størrelsen av det optiske bildeanalysesystemet, noe som fører til unøyaktige overflatespenningsverdier. Det er viktig å nøye undersøke hver nye kapillær etter at den er trukket og belagt under det optiske mikroskopet før kapillæren settes inn i…

Discussion

Den kombinerte CPM/CFM er et kraftig verktøy for å undersøke interfacial dynamikk, likevekt og morfologi. Denne protokollen beskriver trinnene som er nødvendige for å hente data med CPM/CFM.

Figur 2 viser celledesignet med kanaler for kapillær-, løsningsmiddel- og varmevekslingen som er angitt. Innløpet for løsningsmiddelutveksling skal være på bunnen av cellen mens utløpet skal være øverst, slik at cellen ikke kan overløpe under utvekslingen. I pra…

Materials

1.5 O.D. Tygon tubing	Fischer Scientific		Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope	Nikon		Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution			Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix	Alconox	2510	Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter	Sutter Instruments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650471	HPLC Plus
Curosurf	Chiesi		Lung Surfactant
Di Water			18.5 MΩ – cm
Ethanol	any		200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator	Dolan-Jenner Industries Inc.	281900100	Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module	Fluigent	LU-FEZ-0069	Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs	Fluigent		Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets			Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter	Norgren	F07-100-A3TG	Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator	Norgren	10R0400R	Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary	Sutter Instruments	B150-86-10	Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide	any		75 mm x 25 mm
Glass Syringe	Hamilton	84878	25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent	Sigma-Aldrich	667420	1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant	Avanti	850355C-200mg	16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software	National Instruments		2017
Longpass Filter	ThorLabs	FEL0650	650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC	Avanti	855675P	16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head	Masterflex	HV-77916-20	Peristaltic Pump
MATLAB	Mathworks		R2019
Micropipette Puller P-1000	Sutter Instruments		Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder			Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective	Nikon		Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module	National Instruments		Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings	IDEX	F-120x	10-32 Coned Ports
PEEK plug	IDEX	P-551	10-31 Coned Ports
pippette tips	Eppendorf	22492225	100 μL – 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps	Thermo Scientific	6320-0010
Plastic Syringe	Fischer Scientific	14-955-459	10 mL
Plumbing parts	Fischer Scientific		3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL	Eppendorf	3123000063	Micro pipetter
Sulfuric Acid	any		Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm	Nikon		Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt	Thermo Fischer Scientific	1395MP	Fluorophore
Vaccum Pump	Gast	DOA-P704-AA