Microtensiometer para Visualização de Microscopia Confocal de Interfaces Dinâmicas

Summary

Este manuscrito descreve o desenho e o funcionamento de um microscópio microtensiômetro/confocal para fazer medições simultâneas de tensão interfacial e reologia dilatacional superficial enquanto visualiza a morfologia interfacial. Isso proporciona a construção em tempo real das relações estrutura-propriedade de interfaces importantes em tecnologia e fisiologia.

Abstract

A adsorção de moléculas ativas da superfície para interfaces fluido-fluido é onipresente na natureza. Caracterizar essas interfaces requer medir as taxas de adsorção de surfactantes, avaliar as tensões superficiais de equilíbrio em função da concentração de surfactante em massa e relacionar como a tensão superficial muda com as mudanças na área interfacial após o equilíbrio. A visualização simultânea da interface usando imagens de fluorescência com um microscópio confocal de alta velocidade permite a avaliação direta das relações estrutura-função. No microtensiometer de pressão capilar (CPM), uma bolha de ar hemisférica é fixada no final do capilar em um reservatório líquido de volume de 1 mL. A pressão capilar através da interface de bolha é controlada através de um controlador de fluxo microfluido comercial que permite pressão baseada em modelo, curvatura de bolhas ou controle de área de bolha com base na equação de Laplace. Em comparação com técnicas anteriores, como o cocho Langmuir e a queda do pingente, a precisão de medição e controle e o tempo de resposta são muito aprimorados; variações de pressão capilar podem ser aplicadas e controladas em milissegundos. A resposta dinâmica da interface de bolha é visualizada através de uma segunda lente óptica à medida que a bolha se expande e contrai. O contorno da bolha é adequado a um perfil circular para determinar o raio de curvatura da bolha, R, bem como quaisquer desvios de circularidade que invalidariam os resultados. A equação de Laplace é usada para determinar a tensão dinâmica da superfície da interface. Após o equilíbrio, pequenas oscilações de pressão podem ser impostas pela bomba microfluida controlada por computador para oscilar o raio da bolha (frequências de 0,001-100 ciclos/min) para determinar o módulo dilatational As dimensões gerais do sistema são suficientemente pequenas para que o microtensiômetro se encaixe sob a lente de um microscópio confocrática de alta velocidade permitindo que espécies químicas fluorescentes marcadas sejam rastreadas quantitativamente com resolução lateral.

Introduction

Interfaces ar-água cobertas por filmes surfactantes são onipresentes no cotidiano. As injeções de água surfactante são usadas para melhorar a recuperação de óleo de campos empobrecidos e são usadas como soluções de fraturamento hidráulico para gás de xisto e óleo. Espumas gás-líquido e emulsões líquido-líquidos são comuns a muitos processos industriais e científicos como lubrificantes e agentes de limpeza e são comuns em alimentos. Surfactantes e proteínas nas interfaces estabilizam as conformações de anticorpos durante a embalagem, armazenamento e administração 1,2,3,4,5, estabilidade do filme lacrimal no olho ^6,7,8 e mecânica pulmonar ^{9,10,11,12,13,14}, ^{15 anos}.

O estudo de agentes superanativos ou surfactantes que adsorvam interfaces e suas propriedades tem uma longa história com muitas técnicas experimentais diferentes 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Um desenvolvimento recente é o microtensiometer de pressão capilar (CPM), que permite o exame de propriedades interfaciais em interfaces altamente curvas, em escalas de comprimento muito menores, ao mesmo tempo em que utiliza significativamente menos materiais do que outros métodos comuns 9,23,24,25. A microscopia de fluorescência confocal (CFM) pode ser usada para estudar a morfologia de lipídios e proteínas nas interfaces ar-água no CPM²² ou nos cochos langmuir 20,26,27,28,29. Aqui, um CPM e CFM foram combinados para conectar fenômenos morfológicos a propriedades interfaciais dinâmicas e de equilíbrio para desenvolver relações estrutura-função para interfaces biológicas e tecnológicas.

Existem inúmeros parâmetros de importância em sistemas de surfactante interfacial acessíveis ao CPM-CFM. No CPM, uma bolha de ar de 30-200 μm de diâmetro é fixada na ponta de um tubo capilar de vidro. Nas versões anteriores do CPM, a diferença de pressão capilar entre o interior e o exterior da bolha foi controlada através de uma coluna de água e bomba de seringa oscilatória ^9,30 ; a nova versão descrita aqui substitui-as por uma bomba microfluidica de maior precisão, controlada por computador. A tensão superficial (γ) é determinada através da equação de Laplace, ΔP = 2γ/R, a partir da queda de pressão através da interface definida pela bomba, ΔP, e análise óptica do raio de curvatura da bolha, R. A tensão dinâmica da superfície da interface pode ser determinada com resolução de tempo de 10 ms após a geração de uma nova bolha em contato com um líquido a granel contendo um surfactante solúvel. A dinâmica de adsorção surfactante pode ser descrita pela clássica equação Ward-Tordai^10,31 para determinar propriedades essenciais do surfactante, incluindo a difusividade, a cobertura da superfície e a relação entre concentração a granel e tensão superficial de equilíbrio. Uma vez alcançada uma tensão superficial de equilíbrio, a área interfacial pode ser oscilada para medir o módulo dilatational, registrando as mudanças na tensão superficial, induzidas por pequenas mudanças na área da superfície da bolha, A³². Para interfaces mais complexas que desenvolvem suas próprias estruturas internas, como polímeros emaranhados ou proteínas, a tensão superficial, é substituída por um estresse superficial mais geral ^4,33, .

A estabilidade pulmonar durante a respiração pode estar diretamente ligada à manutenção de uma tensão superficial baixa e um módulo dilatational elevado na interface alveolar ar-líquido ^9,10. Todas as superfícies pulmonares internas são forradas com uma película contínua e espessa de fluido de revestimento epitelial para manter a hidratação tecidual³⁴. Este fluido de forro epitelial é principalmente água, com sais e várias outras proteínas, enzimas, açúcares e surfactante pulmonar. Como é o caso de qualquer interface curva de vapor líquido, uma pressão capilar é induzida com a pressão maior no interior do alvéolo (ou bolha). No entanto, se a tensão da superfície era constante em todos os lugares dentro dos pulmões, a equação de Laplace, ΔP = 2γ/R, mostra que alvéolos menores teriam uma pressão interna maior em relação aos alvéolos maiores, forçando o conteúdo gasoso dos alvéolos menores a fluir para alvéolos de menor pressão. Isso é conhecido como “Instabilidade Laplace”^9,35. O resultado líquido é que os menores alvéolos entrariam em colapso e seriam preenchidos com líquido e se tornariam difíceis de reinflar causando o colapso de parte do pulmão, e outras partes inflariam demais, ambas sintomas típicos da síndrome do sofrimento respiratório agudo (ARDS). No entanto, em um pulmão em funcionamento adequado, a tensão da superfície muda dinamicamente à medida que a interface do fluido ar-epitelial na área interfacial alveolus se expande e contrai durante a respiração. Se , ou , a pressão de Laplace diminuir com o raio decrescente e aumenta com o raio crescente de modo a eliminar a instabilidade de Laplace, estabilizando assim o pulmão⁹. Assim, e como depende da frequência, da morfologia e composição da monocameira, e da composição do fluido alveolar pode ser essencial para a estabilidade pulmonar. O CPM-CFM também forneceu as primeiras demonstrações dos efeitos da curvatura interfacial na adsorção^{surfactante 25}, morfologia monocamadas²² e módulo dilatational⁹. O pequeno volume (~1 mL) do reservatório no CPM permite a rápida introdução, remoção ou troca da fase líquida e minimiza a quantidade necessária de proteínas caras ou surfactantes¹⁰.

O contraste em uma imagem CPM-CFM deve-se à distribuição de pequenas frações de lipídios ou proteínas fluorescentes na interface^16,27. Monocamadas surfactantes bidimensionais geralmente exibem separação de fase lateral em função da tensão superficial ou pressão da superfície, π é a diferença entre a tensão superficial de uma interface fluido-fluido limpo, γ₀, e uma interface coberta de surfactante, γ. π pode ser pensado como a “pressão” 2D causada pelas interações de moléculas surfactantes na interface que age para diminuir a superfície de tensão pura. Em baixas pressões superficiais, as monocamadas lipídicas estão em um estado desorganizado semelhante a líquido; isso é conhecido como a fase expandida líquida (LE). À medida que a pressão superficial aumenta e a área por molécula lipídica diminui, os lipídios se orientam entre si e podem passar por uma transição de fase de primeira ordem para a fase^condensada líquida de longo alcance (LC) fase ^16,20,27. As fases LE e LC podem coexistir em várias pressões superficiais e podem ser visualizadas à medida que lipídios marcados fluorescentes são excluídos da fase LC e segregados à fase LE. Assim, a fase LE é brilhante e a fase LC é escura quando imagens com CFM¹⁶.

O objetivo deste manuscrito é descrever os passos necessários para construir e operar o microtensiometer de microscópio confocal combinado. Isso permitirá ao leitor realizar estudos de adsorção, medir a tensão superficial, o comportamento reológico e examinar a morfologia interfacial simultaneamente em uma interface de ar/água/água em escala de míccro ou óleo/água. Isso inclui uma discussão sobre como puxar, cortar e hidrofobizar os capilares necessários, instruções para o uso de modos de controle de pressão, curvatura e área de superfície, e transferência interfacial de surfactante insolúvel para a interface curva do microtensiometer.

Protocol

1. Preparação de tubos capilares Coloque o capilar em um puxador capilar e execute o programa de puxar desejado para fazer dois capilares afilados com um diâmetro externo (OD) de ~1 μm na ponta.NOTA: O OD do capilar antes de puxar deve ser o OD especificado para caber no suporte capilar na célula microtensiômetro. O diâmetro interno (ID) do capilar pode variar, mas afetará o raio crítico do capilar após a puxar. Um programa de puxar é escolhido para que o taper resultante inicial…

Representative Results

Uma das principais fontes de erro de medição surge dos capilares que possuem defeitos, seja do processo de corte (Figura 5A,B) ou do processo de revestimento (Figura 5D). Ambos os tipos de defeitos levam a erros na determinação da forma e tamanho da bolha pelo sistema óptico de análise de imagens, levando a valores imprecisos de tensão superficial. É importante examinar cuidadosamente cada novo capilar depois de ser puxado e revestido so…

Discussion

O CPM/CFM combinado é uma poderosa ferramenta para examinar dinâmicas interfaciais, equilíbrio e morfologia. Este protocolo descreve as etapas necessárias para a obtenção de dados com CPM/CFM.

A Figura 2 mostra o design celular com canais para a troca capilar, solvente e de calor indicada. A entrada para troca de solventes deve estar na parte inferior da célula, enquanto a tomada deve estar na parte superior, permitindo que a célula não transborda durante…

Materials

1.5 O.D. Tygon tubing	Fischer Scientific		Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope	Nikon		Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution			Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix	Alconox	2510	Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter	Sutter Instruments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650471	HPLC Plus
Curosurf	Chiesi		Lung Surfactant
Di Water			18.5 MΩ – cm
Ethanol	any		200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator	Dolan-Jenner Industries Inc.	281900100	Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module	Fluigent	LU-FEZ-0069	Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs	Fluigent		Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets			Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter	Norgren	F07-100-A3TG	Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator	Norgren	10R0400R	Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary	Sutter Instruments	B150-86-10	Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide	any		75 mm x 25 mm
Glass Syringe	Hamilton	84878	25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent	Sigma-Aldrich	667420	1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant	Avanti	850355C-200mg	16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software	National Instruments		2017
Longpass Filter	ThorLabs	FEL0650	650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC	Avanti	855675P	16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head	Masterflex	HV-77916-20	Peristaltic Pump
MATLAB	Mathworks		R2019
Micropipette Puller P-1000	Sutter Instruments		Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder			Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective	Nikon		Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module	National Instruments		Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings	IDEX	F-120x	10-32 Coned Ports
PEEK plug	IDEX	P-551	10-31 Coned Ports
pippette tips	Eppendorf	22492225	100 μL – 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps	Thermo Scientific	6320-0010
Plastic Syringe	Fischer Scientific	14-955-459	10 mL
Plumbing parts	Fischer Scientific		3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL	Eppendorf	3123000063	Micro pipetter
Sulfuric Acid	any		Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm	Nikon		Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt	Thermo Fischer Scientific	1395MP	Fluorophore
Vaccum Pump	Gast	DOA-P704-AA