Summary

Микротензиометр для конфокальной микроскопии Визуализация динамических интерфейсов

Published: September 09, 2022
doi:

Summary

Эта рукопись описывает конструкцию и работу микротензиометра / конфокального микроскопа для одновременного измерения межфазного натяжения и поверхностной дилатационной реологии при визуализации межфазной морфологии. Это обеспечивает построение в реальном времени отношений структура-свойство интерфейсов, важных в технике и физиологии.

Abstract

Адсорбция поверхностно-активных молекул к интерфейсам жидкость-жидкость повсеместно распространена в природе. Характеристика этих интерфейсов требует измерения скорости адсорбции поверхностно-активных веществ, оценки равновесного поверхностного напряжения как функции объемной концентрации поверхностно-активного вещества и сопоставления того, как поверхностное натяжение изменяется с изменениями в межфазной области после равновесия. Одновременная визуализация интерфейса с использованием флуоресцентной визуализации с помощью высокоскоростного конфокального микроскопа позволяет непосредственно оценить структурно-функциональные отношения. В микротензиометре капиллярного давления (CPM) полусферический воздушный пузырь зажимается на конце капилляра в резервуаре жидкости объемом 1 мл. Капиллярное давление через пузырьковый интерфейс контролируется с помощью коммерческого микрофлюидного контроллера потока, который позволяет управлять давлением на основе модели, кривизной пузырьков или зоной пузырьков на основе уравнения Лапласа. По сравнению с предыдущими методами, такими как желоб Ленгмюра и подвесное падение, точность измерения и управления и время отклика значительно улучшены; изменения капиллярного давления могут применяться и контролироваться в миллисекундах. Динамический отклик пузырькового интерфейса визуализируется через вторую оптическую линзу, когда пузырь расширяется и сжимается. Контур пузырька подходит к круглому профилю для определения радиуса кривизны пузырька, R, а также любых отклонений от циркулярности, которые могут аннулировать результаты. Уравнение Лапласа используется для определения динамического поверхностного натяжения интерфейса. После уравновешивания небольшие колебания давления могут быть наложены управляемым компьютером микрофлюидным насосом для колебания радиуса пузырька (частоты 0,001-100 циклов / мин) для определения модуля дилатации Общие размеры системы достаточно малы, чтобы микротензиометр помещался под линзой высокоскоростного конфокального микроскопа, позволяя количественно отслеживать флуоресцентно помеченные химические виды с субмикронным боковым разрешением.

Introduction

Воздушно-водные интерфейсы, покрытые поверхностно-активными пленками, повсеместно распространены в повседневной жизни. Закачки поверхностно-активного раствора используются для повышения нефтеотдачи с истощенных месторождений и используются в качестве решений для гидравлического разрыва сланцевого газа и нефти. Газожидкостные пены и жидко-жидкие эмульсии являются общими для многих промышленных и научных процессов в качестве смазочных материалов и чистящих средств и распространены в пищевых продуктах. Поверхностно-активные вещества и белки на границах раздела стабилизируют конформацию антител при упаковке, хранении и введении 1,2,3,4,5, стабильность слезной пленки в глазу 6,7,8 и легочную механику 9,10,11,12,13,14, 15.

Изучение поверхностно-активных агентов или поверхностно-активных веществ, адсорбирующих интерфейсы и их свойства, имеет долгую историю со многими различными экспериментальными методами 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Недавней разработкой является микротензиометр капиллярного давления (CPM), который позволяет исследовать межфазные свойства на сильно изогнутых интерфейсах в гораздо меньших масштабах длины, используя при этом значительно меньше материалов, чем другие распространенные методы 9,23,24,25. Конфокальная флуоресцентная микроскопия (CFM) может быть использована для изучения морфологии липидов и белков на границах раздела воздух-вода в CPM22 или на впадинах Ленгмюра 20,26,27,28,29. Здесь CPM и CFM были объединены для связи морфологических явлений с динамическими и равновесными межфазными свойствами для развития структурно-функциональных отношений для биологических и технологических интерфейсов.

Существует множество важных параметров в межфазных поверхностно-активных системах, доступных для CPM-CFM. В CPM воздушный пузырь диаметром 30-200 мкм прижимается к кончику стеклянной капиллярной трубки. В более ранних версиях CPM разность капиллярного давления между внутренней и внешней частью пузыря контролировалась с помощью водяного столба и колебательного шприцевого насоса 9,30; новая версия, описанная здесь, заменяет их более высокоточным микрофлюидным насосом с компьютерным управлением. Поверхностное натяжение (γ) определяется с помощью уравнения Лапласа, ΔP = 2γ/R, из перепада давления через интерфейс, заданного насосом, ΔP и оптического анализа радиуса кривизны пузыря, R. Динамическое поверхностное натяжение интерфейса может быть определено с временным разрешением 10 мс после образования нового пузырька, контактирующего с объемной жидкостью, содержащей растворимое поверхностно-активное вещество. Динамика адсорбции поверхностно-активного вещества может быть описана классическим уравнением Уорда-Тордая10,31 для определения существенных свойств поверхностно-активного вещества, включая диффузионность, поверхностное покрытие и взаимосвязь между объемной концентрацией и равновесным поверхностным натяжением. Как только достигается равновесное поверхностное натяжение, межфазная область может колебаться для измерения дилатационного модуля, Equation 1регистрируя изменения поверхностного натяжения, вызванные небольшими изменениями в площади поверхности пузыря, A32. Для более сложных интерфейсов, которые развивают свои собственные внутренние структуры, такие как запутанные полимеры или белки, поверхностное натяжение, заменяется более общим поверхностным напряжением 4,33, Equation 2.

Стабильность легких во время дыхания может быть напрямую связана с поддержанием как низкого поверхностного натяжения, так и высокого модуля дилатации на альвеолярной воздушно-жидкостной границе раздела 9,10. Все внутренние поверхности легких выстланы непрерывной пленкой эпителиальной выстилающей жидкости толщиной в микроны для поддержания гидратации тканей34. Эта эпителиальная подкладочная жидкость в основном представляет собой воду, с солями и различными другими белками, ферментами, сахарами и поверхностно-активным веществом для легких. Как и в случае с любой изогнутой границей раздела жидкость-пар, капиллярное давление индуцируется давлением выше на внутренней стороне альвеолы (или пузыря). Однако, если поверхностное натяжение было постоянным везде в легких, уравнение Лапласа, ΔP = 2γ / R, показывает, что меньшие альвеолы будут иметь более высокое внутреннее давление по сравнению с более крупными альвеолами, заставляя газовое содержимое меньших альвеол перетекать в более крупные альвеолы с более низким давлением. Это известно как «нестабильность Лапласа»9,35. Конечным результатом является то, что мельчайшие альвеолы разрушаются и заполняются жидкостью и становятся трудными для повторного раздувания, вызывая коллапс части легкого, а другие части будут чрезмерно раздуваться, оба из которых являются типичными симптомами острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Однако в правильно функционирующем легком поверхностное натяжение динамически изменяется, поскольку граница раздела воздух-эпителиальная жидкость в межфазной области альвеол расширяется и сжимается во время дыхания. Если Equation 3, или Equation 4, давление Лапласа уменьшается с уменьшением радиуса и увеличивается с увеличением радиуса, чтобы устранить нестабильность Лапласа, тем самым стабилизируя легкое9. Следовательно, и то, Equation 5как это зависит от частоты, морфологии и состава монослоя, а также состава альвеолярной жидкости, может иметь важное значение для стабильности легких. CPM-CFM также обеспечил первые демонстрации влияния межфазной кривизны на адсорбцию поверхностно-активных веществ25, монослойную морфологию22 и дилатационный модуль9. Небольшой объем (~1 мл) резервуара в CPM позволяет быстро вводить, удалять или обменивать жидкую фазу и сводит к минимуму необходимое количество дорогостоящих белков или поверхностно-активных веществ10.

Контрастность в изображении CPM-CFM обусловлена распределением малых фракций флуоресцентно меченых липидов или белков на границераздела 16,27. Двумерные монослои поверхностно-активного вещества часто демонстрируют боковое фазовое разделение в зависимости от поверхностного натяжения или поверхностного давления, Equation 6 π представляет собой разницу между поверхностным натяжением чистой границы раздела жидкость-жидкость, γ0, и интерфейсом, покрытым поверхностно-активным веществом, γ. π можно рассматривать как 2-D «давление», вызванное взаимодействиями молекул поверхностно-активного вещества на границе раздела, который действует для снижения поверхностного натяжения чистой жидкости. При низком поверхностном давлении липидные монослои находятся в жидком дезорганизованном состоянии; это называется жидкой расширенной (LE) фазой. По мере увеличения поверхностного давления и уменьшения площади на молекулу липида липиды ориентируются друг с другом и могут подвергаться фазовому переходу первого порядка в фазовую фазу длинного порядка с конденсированной жидкостью (LC) 16,20,27. Фазы LE и LC могут сосуществовать при различных поверхностных давлениях и могут быть визуализированы, поскольку флуоресцентно помеченные липиды исключаются из фазы LC и отделяются от фазы LE. Таким образом, фаза LE яркая, а фаза LC темная при изображении с помощью CFM16.

Целью этой рукописи является описание шагов, необходимых для создания и эксплуатации комбинированного микроскопического микроскопического микроскопа. Это позволит читателю выполнять адсорбционные исследования, измерять поверхностное натяжение, реологическое поведение и одновременно изучать межфазную морфологию на микронной границе раздела воздух/вода или масло/вода. Это включает в себя обсуждение того, как вытягивать, разрезать и гидрофобизировать необходимые капилляры, инструкции по использованию режимов давления, кривизны и контроля площади поверхности, а также межфазный перенос нерастворимого поверхностно-активного вещества на изогнутый интерфейс микротензиометра.

Protocol

1. Подготовка капиллярных трубок Поместите капилляр в капиллярный съемник и запустите нужную программу вытягивания, чтобы сделать два конических капилляра с наружным диаметром (OD) ~ 1 мкм на кончике.ПРИМЕЧАНИЕ: OD капилляра перед вытягиванием должен соответствовать OD, ук…

Representative Results

Основным источником погрешности измерений являются капилляры, дефекты которых возникают либо в процессе резки (рисунок 5A, B), либо в процессе нанесения покрытия (рисунок 5D). Оба типа дефектов приводят к ошибкам в определении формы и размера пузыр…

Discussion

Комбинированный CPM/CFM является мощным инструментом для изучения межфазной динамики, равновесия и морфологии. Этот протокол описывает шаги, необходимые для получения данных с помощью CPM/CFM.

На фиг.2 показана конструкция ячейки с указанными каналами для капи…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Все изображения конфокальной микроскопии были получены с помощью многофотонного конфокального микроскопа Nikon A1RHD. Мы признаем руководство и помощь вспомогательного персонала, особенно Гильермо Маркеса, в Университетском центре визуализации в Университете Миннесоты. Эта работа была поддержана грантом NIH HL51177. SI был поддержан грантом Рут Л. Киршштейн NRSA на институциональную исследовательскую подготовку F32 HL151128.

Materials

1.5 O.D. Tygon tubing Fischer Scientific Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope Nikon Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix Alconox 2510 Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter Sutter Instruments
Chloroform Sigma-Aldrich 650471 HPLC Plus
Curosurf Chiesi  Lung Surfactant
Di Water 18.5 MΩ – cm
Ethanol any 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator Dolan-Jenner Industries Inc. 281900100 Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module Fluigent LU-FEZ-0069 Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs Fluigent Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter Norgren F07-100-A3TG Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator Norgren 10R0400R Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary Sutter Instruments B150-86-10 Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide any 75 mm x 25 mm
Glass Syringe Hamilton 84878 25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent Sigma-Aldrich 667420 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant Avanti 850355C-200mg 16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software National Instruments 2017
Longpass Filter ThorLabs FEL0650 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC Avanti 855675P 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head Masterflex HV-77916-20 Peristaltic Pump
MATLAB Mathworks R2019
Micropipette Puller P-1000 Sutter Instruments Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective Nikon Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module National Instruments Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings IDEX F-120x 10-32 Coned Ports
PEEK plug IDEX P-551 10-31 Coned Ports
pippette tips Eppendorf 22492225 100 μL – 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps Thermo Scientific 6320-0010
Plastic Syringe Fischer Scientific 14-955-459 10 mL
Plumbing parts Fischer Scientific 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL Eppendorf 3123000063 Micro pipetter
Sulfuric Acid any Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm Nikon Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt Thermo Fischer Scientific 1395MP Fluorophore
Vaccum Pump Gast DOA-P704-AA

Referências

  1. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Interfacial rheology of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface: Comparison of shear and dilatation deformation. Journal of Physical Chemistry B. 108 (12), 3835-3844 (2004).
  2. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Shear and dilatational relaxation mechanisms of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface. Langmuir. 20 (23), 10159-10167 (2004).
  3. Kannan, A., Shieh, I. C., Fuller, G. G. Linking aggregation and interfacial properties in monoclonal antibody-surfactant formulations. Journal of Colloid and Interface Science. 550, 128-138 (2019).
  4. Kannan, A., Shieh, I. C., Leiske, D. L., Fuller, G. G. Monoclonal antibody interfaces: Dilatation mechanics and bubble coalescence. Langmuir. 34 (2), 630-638 (2018).
  5. Li, J. J., et al. Interfacial stress in the development of biologics: Fundamental understanding, current practice, and future perspective. The AAPS Journal. 21 (3), 44 (2019).
  6. Bhamla, M. S., Giacomin, C. E., Balemans, C., Fuller, G. G. Influence of interfacial rheology on drainage from curved surfaces. Soft Matter. 10 (36), 6917-6925 (2014).
  7. Fuller, G. G., Vermant, J. Complex fluid-fluid interfaces: Rheology and structure. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 3, 519-543 (2012).
  8. Rosenfeld, L., et al. Structural and rheological properties of meibomian lipid. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 2720-2732 (2013).
  9. Barman, S., Davidson, M. L., Walker, L. M., Anna, S. L., Zasadzinski, J. A. Inflammation product effects on dilatational mechanics can trigger the Laplace instability and acute respiratory distress syndrome. Soft Matter. 16 (29), 6890-6901 (2020).
  10. Barman, S., et al., Ramachadran, A., et al. . Recent Advances in Rheology: Theory, Biorheology, Suspension and Interfacial Rheology. , (2022).
  11. Alonso, C., Zasadzinski, J. A. A brief review of the relationship between monolayer viscosity, phase behavior, surface pressure and temperature using a simple monolayer viscometer. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (44), 22185-22191 (2006).
  12. Alonso, C., et al. More than a monolayer: Relating lung surfactant structure and mechanics to composition. Biophysical Journal. 87 (6), 4188-4202 (2004).
  13. Alonso, C., Bringezu, F., Brezesinski, G., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Modifying calf lung surfactant by hexadecanol. Langmuir. 21 (3), 1028-1035 (2005).
  14. Alonso, C., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: Protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophysical Journal. 89 (1), 266-273 (2005).
  15. Zasadzinski, J. A., et al. Inhibition of pulmonary surfactant adsorption by serum and the mechanisms of reversal by hydrophilic polymers: Theory. Biophysical Journal. 89 (3), 1621-1629 (2005).
  16. McConnell, H. M. Structures and transitions in lipid monolayers at the air-water-interface. Annual Reviews of Physical Chemistry. 42, 171-195 (1991).
  17. McConnell, H. M., Moy, V. T. Shapes of finite two-dimensional lipid domains. Journal of Physical Chemistry. 92 (15), 4520-4525 (1988).
  18. Zasadzinski, J. A., Stenger, P., Shieh, I., Dhar, P. Overcoming rapid inactivation of lung surfactant: analogies between competitive adsorption and colloid stability. Biochemica et Biophysica Acta. 1798 (4), 801-828 (2010).
  19. Zasadzinski, J. A., Nag, K., et al. . Surfactant Progress. , (2008).
  20. Valtierrez-Gaytan, C., et al. Spontaneous evolution of equilibrium morphology in phospholipid-cholesterol monolayers. Science Advances. 8 (14), (2022).
  21. Williams, I., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial rheology and direct imaging reveal domain-templated network formation in phospholipid monolayers penetrated by fibrinogen. Soft Matter. 15 (44), 9076-9084 (2019).
  22. Sachan, A. K., Zasadzinski, J. A. Interfacial curvature effects on the monolayer morphology and dynamics of a clinical lung surfactant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 134-143 (2018).
  23. Alvarez, N. J., Anna, S. L., Saigal, T., Tilton, R. D., Walker, L. M. Intefacial dynamics and rheology of polymer grafter nanoparticles at air-water and xylene-water interfaces. Langmuir. 28 (21), 8052-8063 (2012).
  24. Alvarez, N. J., Vogus, D. R., Walker, L. M., Anna, S. L. Using bulk convection in a microtensiometer to approach kinetic-limited surfactant dynamics at fluid-fluid interfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 372 (1), 183-191 (2012).
  25. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. Diffusion-limited adsorption to a spherical geometry: The impact of curvature and competitive time scales. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82, 011604 (2010).
  26. Shieh, I., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Visualizing the analogy between competitive adsorption and colloid stability to restore lung surfactant function. Biophysical Journal. 102 (4), 777-786 (2012).
  27. Shieh, I., Zasadzinski, J. A. Visualizing monolayers with a water-soluble fluorophore to quantify adsorption, desorption and the double-layer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 826-835 (2015).
  28. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Takamoto, D. Y., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Coexistence of buckled and flat monolayers. Physical Review Letters. 81, 1650-1653 (1998).
  29. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Fluorescence, polarized fluorescence, and Brewster angle microscopy of palmitic acid and lung surfactant protein B monolayers. Biophysical Journal. 72 (6), 2783-2804 (1997).
  30. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. A microtensiometer to probe the effect of radius of curvature on surfactant transport to a spherical interface. Langmuir. 26 (16), 13310-13319 (2010).
  31. Ward, A. F. H., Tordai, L. Time dependents of boundary tensions of solutions. 1. The role of diffusion in time-effects. Journal of Chemical Physics. 14, 453-461 (1946).
  32. Lucassen, J., Vanden Tempel, M. Dynamic measurements of dilatational properties of a liquid interface. Chemical Engineering Science. 27 (6), 1283-1291 (1972).
  33. Lin, G. L., et al. Interfacial dilatational deformation accelerates particle formation in monoclonal antibody solutions. Soft Matter. 12 (14), 3293-3302 (2016).
  34. Bastacky, J., et al. Alveolar lining layer is thin and continuous: low temperature scanning electron microscopy of rat lung. Journal of Applied Physiology. 79 (5), 1615-1628 (1995).
  35. Adamson, A. W., Gast, A. P. . Physical Chemistry of Surfaces, Sixth ed. , 784 (1997).
  36. del Rio, O. I., Kwok, D. Y., Wu, R., Alvarez, J. M., Neumann, A. W. Contact angle measurements by axisymmetric drop shape analysis and an automated polynomial fit program. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects. 143 (2-3), 197-210 (1998).
  37. Kanthe, A., et al. No ordinary proteins: Adsorption and molecular orientation of monoclonal antibodies. Science Advances. 7 (5), 14 (2021).
  38. Manikantan, H., Squires, T. M. Surfactant dynamics: hidden variables controlling fluid flows. Journal of Fluid Mechanics. 892, 115 (2020).
  39. Narayan, S., et al. Dilatational rheology of water-in-diesel fuel interfaces: effect of surfactant concentration and bulk-to-interface exchange. Soft Matter. 17 (18), 4751-4765 (2021).
  40. Meng, G. N., Paulose, J., Nelson, D. R., Manoharan, V. N. Elastic instability of a crystal growing on a curved surface. Science. 343 (6171), 634-637 (2014).
  41. Kotula, A. P., Anna, S. L. Insoluble layer deposition and dilatational rheology at a microscale spherical cap interface. Soft Matter. 12 (33), 7038-7055 (2016).
  42. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Phase and morphology changes in lipid monolayers induced by SP-B protein and its amino-terminal peptide. Science. 273 (5279), 1196-1199 (1996).
  43. Pocivavsek, L., et al. Stress and fold localization in thin elastic membranes. Science. 320 (5878), 912-916 (2008).
  44. Pocivavsek, L., et al. Lateral stress relaxation and collapse in lipid monolayers. Soft Matter. 4 (10), 2019-2029 (2008).
  45. Kim, K., Choi, S. Q., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Cholesterol nanodomains: their effect on monolayer morphology and dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 3054-3060 (2013).
  46. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
  47. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Nonlinear chiral rheology of phospholipid monolayers. Soft Matter. 14 (13), 2476-2483 (2018).
  48. Kotula, A. P., Anna, S. L. Regular perturbation analysis of small amplitude oscillatory dilatation of an interface in a capillary pressure tensiometer. Journal of Rheology. 59, 85-117 (2015).

Play Video

Citar este artigo
Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, C., Huang, B., Davidson, M. L., Zasadzinski, J. A. Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces. J. Vis. Exp. (187), e64110, doi:10.3791/64110 (2022).

View Video