Эта рукопись описывает конструкцию и работу микротензиометра / конфокального микроскопа для одновременного измерения межфазного натяжения и поверхностной дилатационной реологии при визуализации межфазной морфологии. Это обеспечивает построение в реальном времени отношений структура-свойство интерфейсов, важных в технике и физиологии.
Адсорбция поверхностно-активных молекул к интерфейсам жидкость-жидкость повсеместно распространена в природе. Характеристика этих интерфейсов требует измерения скорости адсорбции поверхностно-активных веществ, оценки равновесного поверхностного напряжения как функции объемной концентрации поверхностно-активного вещества и сопоставления того, как поверхностное натяжение изменяется с изменениями в межфазной области после равновесия. Одновременная визуализация интерфейса с использованием флуоресцентной визуализации с помощью высокоскоростного конфокального микроскопа позволяет непосредственно оценить структурно-функциональные отношения. В микротензиометре капиллярного давления (CPM) полусферический воздушный пузырь зажимается на конце капилляра в резервуаре жидкости объемом 1 мл. Капиллярное давление через пузырьковый интерфейс контролируется с помощью коммерческого микрофлюидного контроллера потока, который позволяет управлять давлением на основе модели, кривизной пузырьков или зоной пузырьков на основе уравнения Лапласа. По сравнению с предыдущими методами, такими как желоб Ленгмюра и подвесное падение, точность измерения и управления и время отклика значительно улучшены; изменения капиллярного давления могут применяться и контролироваться в миллисекундах. Динамический отклик пузырькового интерфейса визуализируется через вторую оптическую линзу, когда пузырь расширяется и сжимается. Контур пузырька подходит к круглому профилю для определения радиуса кривизны пузырька, R, а также любых отклонений от циркулярности, которые могут аннулировать результаты. Уравнение Лапласа используется для определения динамического поверхностного натяжения интерфейса. После уравновешивания небольшие колебания давления могут быть наложены управляемым компьютером микрофлюидным насосом для колебания радиуса пузырька (частоты 0,001-100 циклов / мин) для определения модуля дилатации Общие размеры системы достаточно малы, чтобы микротензиометр помещался под линзой высокоскоростного конфокального микроскопа, позволяя количественно отслеживать флуоресцентно помеченные химические виды с субмикронным боковым разрешением.
Воздушно-водные интерфейсы, покрытые поверхностно-активными пленками, повсеместно распространены в повседневной жизни. Закачки поверхностно-активного раствора используются для повышения нефтеотдачи с истощенных месторождений и используются в качестве решений для гидравлического разрыва сланцевого газа и нефти. Газожидкостные пены и жидко-жидкие эмульсии являются общими для многих промышленных и научных процессов в качестве смазочных материалов и чистящих средств и распространены в пищевых продуктах. Поверхностно-активные вещества и белки на границах раздела стабилизируют конформацию антител при упаковке, хранении и введении 1,2,3,4,5, стабильность слезной пленки в глазу 6,7,8 и легочную механику 9,10,11,12,13,14, 15.
Изучение поверхностно-активных агентов или поверхностно-активных веществ, адсорбирующих интерфейсы и их свойства, имеет долгую историю со многими различными экспериментальными методами 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Недавней разработкой является микротензиометр капиллярного давления (CPM), который позволяет исследовать межфазные свойства на сильно изогнутых интерфейсах в гораздо меньших масштабах длины, используя при этом значительно меньше материалов, чем другие распространенные методы 9,23,24,25. Конфокальная флуоресцентная микроскопия (CFM) может быть использована для изучения морфологии липидов и белков на границах раздела воздух-вода в CPM22 или на впадинах Ленгмюра 20,26,27,28,29. Здесь CPM и CFM были объединены для связи морфологических явлений с динамическими и равновесными межфазными свойствами для развития структурно-функциональных отношений для биологических и технологических интерфейсов.
Существует множество важных параметров в межфазных поверхностно-активных системах, доступных для CPM-CFM. В CPM воздушный пузырь диаметром 30-200 мкм прижимается к кончику стеклянной капиллярной трубки. В более ранних версиях CPM разность капиллярного давления между внутренней и внешней частью пузыря контролировалась с помощью водяного столба и колебательного шприцевого насоса 9,30; новая версия, описанная здесь, заменяет их более высокоточным микрофлюидным насосом с компьютерным управлением. Поверхностное натяжение (γ) определяется с помощью уравнения Лапласа, ΔP = 2γ/R, из перепада давления через интерфейс, заданного насосом, ΔP и оптического анализа радиуса кривизны пузыря, R. Динамическое поверхностное натяжение интерфейса может быть определено с временным разрешением 10 мс после образования нового пузырька, контактирующего с объемной жидкостью, содержащей растворимое поверхностно-активное вещество. Динамика адсорбции поверхностно-активного вещества может быть описана классическим уравнением Уорда-Тордая10,31 для определения существенных свойств поверхностно-активного вещества, включая диффузионность, поверхностное покрытие и взаимосвязь между объемной концентрацией и равновесным поверхностным натяжением. Как только достигается равновесное поверхностное натяжение, межфазная область может колебаться для измерения дилатационного модуля, регистрируя изменения поверхностного натяжения, вызванные небольшими изменениями в площади поверхности пузыря, A32. Для более сложных интерфейсов, которые развивают свои собственные внутренние структуры, такие как запутанные полимеры или белки, поверхностное натяжение, заменяется более общим поверхностным напряжением 4,33,
.
Стабильность легких во время дыхания может быть напрямую связана с поддержанием как низкого поверхностного натяжения, так и высокого модуля дилатации на альвеолярной воздушно-жидкостной границе раздела 9,10. Все внутренние поверхности легких выстланы непрерывной пленкой эпителиальной выстилающей жидкости толщиной в микроны для поддержания гидратации тканей34. Эта эпителиальная подкладочная жидкость в основном представляет собой воду, с солями и различными другими белками, ферментами, сахарами и поверхностно-активным веществом для легких. Как и в случае с любой изогнутой границей раздела жидкость-пар, капиллярное давление индуцируется давлением выше на внутренней стороне альвеолы (или пузыря). Однако, если поверхностное натяжение было постоянным везде в легких, уравнение Лапласа, ΔP = 2γ / R, показывает, что меньшие альвеолы будут иметь более высокое внутреннее давление по сравнению с более крупными альвеолами, заставляя газовое содержимое меньших альвеол перетекать в более крупные альвеолы с более низким давлением. Это известно как «нестабильность Лапласа»9,35. Конечным результатом является то, что мельчайшие альвеолы разрушаются и заполняются жидкостью и становятся трудными для повторного раздувания, вызывая коллапс части легкого, а другие части будут чрезмерно раздуваться, оба из которых являются типичными симптомами острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Однако в правильно функционирующем легком поверхностное натяжение динамически изменяется, поскольку граница раздела воздух-эпителиальная жидкость в межфазной области альвеол расширяется и сжимается во время дыхания. Если , или
, давление Лапласа уменьшается с уменьшением радиуса и увеличивается с увеличением радиуса, чтобы устранить нестабильность Лапласа, тем самым стабилизируя легкое9. Следовательно, и то,
как это зависит от частоты, морфологии и состава монослоя, а также состава альвеолярной жидкости, может иметь важное значение для стабильности легких. CPM-CFM также обеспечил первые демонстрации влияния межфазной кривизны на адсорбцию поверхностно-активных веществ25, монослойную морфологию22 и дилатационный модуль9. Небольшой объем (~1 мл) резервуара в CPM позволяет быстро вводить, удалять или обменивать жидкую фазу и сводит к минимуму необходимое количество дорогостоящих белков или поверхностно-активных веществ10.
Контрастность в изображении CPM-CFM обусловлена распределением малых фракций флуоресцентно меченых липидов или белков на границераздела 16,27. Двумерные монослои поверхностно-активного вещества часто демонстрируют боковое фазовое разделение в зависимости от поверхностного натяжения или поверхностного давления, π представляет собой разницу между поверхностным натяжением чистой границы раздела жидкость-жидкость, γ0, и интерфейсом, покрытым поверхностно-активным веществом, γ. π можно рассматривать как 2-D «давление», вызванное взаимодействиями молекул поверхностно-активного вещества на границе раздела, который действует для снижения поверхностного натяжения чистой жидкости. При низком поверхностном давлении липидные монослои находятся в жидком дезорганизованном состоянии; это называется жидкой расширенной (LE) фазой. По мере увеличения поверхностного давления и уменьшения площади на молекулу липида липиды ориентируются друг с другом и могут подвергаться фазовому переходу первого порядка в фазовую фазу длинного порядка с конденсированной жидкостью (LC) 16,20,27. Фазы LE и LC могут сосуществовать при различных поверхностных давлениях и могут быть визуализированы, поскольку флуоресцентно помеченные липиды исключаются из фазы LC и отделяются от фазы LE. Таким образом, фаза LE яркая, а фаза LC темная при изображении с помощью CFM16.
Целью этой рукописи является описание шагов, необходимых для создания и эксплуатации комбинированного микроскопического микроскопического микроскопа. Это позволит читателю выполнять адсорбционные исследования, измерять поверхностное натяжение, реологическое поведение и одновременно изучать межфазную морфологию на микронной границе раздела воздух/вода или масло/вода. Это включает в себя обсуждение того, как вытягивать, разрезать и гидрофобизировать необходимые капилляры, инструкции по использованию режимов давления, кривизны и контроля площади поверхности, а также межфазный перенос нерастворимого поверхностно-активного вещества на изогнутый интерфейс микротензиометра.
Комбинированный CPM/CFM является мощным инструментом для изучения межфазной динамики, равновесия и морфологии. Этот протокол описывает шаги, необходимые для получения данных с помощью CPM/CFM.
На фиг.2 показана конструкция ячейки с указанными каналами для капи…
The authors have nothing to disclose.
Все изображения конфокальной микроскопии были получены с помощью многофотонного конфокального микроскопа Nikon A1RHD. Мы признаем руководство и помощь вспомогательного персонала, особенно Гильермо Маркеса, в Университетском центре визуализации в Университете Миннесоты. Эта работа была поддержана грантом NIH HL51177. SI был поддержан грантом Рут Л. Киршштейн NRSA на институциональную исследовательскую подготовку F32 HL151128.
1.5 O.D. Tygon tubing | Fischer Scientific | Tubing | |
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope | Nikon | Confocal Microscope | |
Acid Cleaning Solution | Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting | ||
Alnochromix | Alconox | 2510 | Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution |
Ceramic glass cutter | Sutter Instruments | ||
Chloroform | Sigma-Aldrich | 650471 | HPLC Plus |
Curosurf | Chiesi | Lung Surfactant | |
Di Water | 18.5 MΩ – cm | ||
Ethanol | any | 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning | |
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator | Dolan-Jenner Industries Inc. | 281900100 | Light source; other light sources should work as well |
Flow EZ F69 mbar w/Link Module | Fluigent | LU-FEZ-0069 | Microfluidic Pump |
Fluigent SDK VIs | Fluigent | Required for CPM virtual Interface | |
Fluoroelastomer gaskets | Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3 | ||
Gas filter | Norgren | F07-100-A3TG | Put between microfluidic pump and pressure regulator |
Gas regulator | Norgren | 10R0400R | Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi |
Glass Capilary | Sutter Instruments | B150-86-10 | Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm |
Glass Slide | any | 75 mm x 25 mm | |
Glass Syringe | Hamilton | 84878 | 25 μL glass syringe |
Hydrophobizing Agent | Sigma-Aldrich | 667420 | 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted |
Insoluble surfactant | Avanti | 850355C-200mg | 16:0 DPPC in chloroform |
LabVIEW Software | National Instruments | 2017 | |
Longpass Filter | ThorLabs | FEL0650 | 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence |
Lyso-PC | Avanti | 855675P | 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine |
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/ Easy-Load II pump head | Masterflex | HV-77916-20 | Peristaltic Pump |
MATLAB | Mathworks | R2019 | |
Micropipette Puller P-1000 | Sutter Instruments | Capillary Puller | |
Microtensiometer Cell and Holder | Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4 | ||
Microtensiometer Objective | Nikon | Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm | |
NI Vision Development Module | National Instruments | Required for CPM virtual Interface | |
PEEK finger tight fittings | IDEX | F-120x | 10-32 Coned Ports |
PEEK plug | IDEX | P-551 | 10-31 Coned Ports |
pippette tips | Eppendorf | 22492225 | 100 μL – 1000 μL, Autoclaved |
Plastic Forceps | Thermo Scientific | 6320-0010 | |
Plastic Syringe | Fischer Scientific | 14-955-459 | 10 mL |
Plumbing parts | Fischer Scientific | 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing. | |
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL | Eppendorf | 3123000063 | Micro pipetter |
Sulfuric Acid | any | Used for acid cleaning solution | |
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm | Nikon | Confocal Microscope Objective | |
Texas Red DHPE triethylammonim salt | Thermo Fischer Scientific | 1395MP | Fluorophore |
Vaccum Pump | Gast | DOA-P704-AA |