Protokollen beskriver, hvordan man genererer knock-out myoblaster ved hjælp af CRISPR/Cas9, startende fra design af guide-RNA’er til den cellulære kloning og karakterisering af knock-out klonerne.
En vigtig anvendelse af clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 er udviklingen af knock-out cellelinjer, specifikt for at studere funktionen af nye gener/proteiner forbundet med en sygdom, identificeret under den genetiske diagnose. For udviklingen af sådanne cellelinjer skal to hovedspørgsmål løses: indsættelse af CRISPR-værktøjerne (Cas9 og guide RNA) med høj effektivitet i de valgte celler og begrænsning af Cas9-aktiviteten til den specifikke deletion af det valgte gen. Protokollen beskrevet her er dedikeret til indsættelse af CRISPR-værktøjerne i vanskelige at transfektere celler, såsom muskelceller. Denne protokol er baseret på brugen af lentivirus, produceret med plasmider offentligt tilgængelige, for hvilke alle kloningstrin er beskrevet for at målrette mod et gen af interesse. Kontrollen af Cas9-aktivitet er blevet udført ved hjælp af en tilpasning af et tidligere beskrevet system kaldet KamiCas9, hvor transduktionen af cellerne med et lentivirus, der koder for et guide-RNA rettet mod Cas9, muliggør progressiv afskaffelse af Cas9-ekspression. Denne protokol er blevet anvendt til udviklingen af en RYR1-knock out human muskelcellelinje, som er blevet yderligere karakteriseret på protein- og funktionsniveau, for at bekræfte knockout af denne vigtige calciumkanal involveret i muskel intracellulær calciumfrigivelse og i excitations-sammentrækningskobling. Den procedure, der er beskrevet her, kan let anvendes på andre gener i muskelceller eller i andre vanskelige at transfekte celler og producere værdifulde værktøjer til at studere disse gener i humane celler.
Med udviklingen af gensekventering og identifikation af mutationer i gener af ukendte funktioner i et specifikt væv udgør udviklingen af relevante cellulære modeller til at forstå funktionen af et nyt målgen og bekræfte dets involvering i de relaterede patofysiologiske mekanismer et vigtigt redskab. Desuden er disse modeller af stor betydning for den fremtidige terapeutiske udvikling 1,2 og udgør et interessant alternativ til udviklingen af knock-out dyremodeller i lige linje med de internationale anbefalinger om reduktion af brugen af dyr til forsøg. Genredigering ved hjælp af CRISPR/Cas9 er blandt de mest kraftfulde værktøjer, der i øjeblikket er tilgængelige, hvilket har muliggjort udviklingen af mange knock-out/knock-in-modeller, og målrettet genvalidering ved hjælp af CRISPR/Cas9 er blandt de mest anvendte anvendelser af CRISPR/Cas93. Succesen med genredigering afhænger af evnen til at introducere CRISPR-værktøjerne (guide RNA’erne og nukleasen Cas9) i målcellemodellen, hvilket kan være en udfordring i mange vanskelige at transfekte celler, såsom muskelceller4. Denne udfordring kan overvindes ved brug af virus, normalt lentivirus, som har den store fordel at transducere effektivt mange celletyper og levere dets transgen. Men dens største ulempe er integrationen af transgenet i værtscellegenomet, hvilket fører til potentiel ændring af gener lokaliseret på integrationsstedet og til permanent ekspression af transgenet, hvilket i tilfælde af nukleasen Cas9 ville resultere i skadelige konsekvenser5. En smart løsning er blevet foreslået af Merienne og kolleger6, som består i introduktion i cellerne af et guide-RNA rettet mod selve Cas9-genet, hvilket fører til Cas9-inaktivering. En tilpasning af denne strategi præsenteres her som en brugervenlig og alsidig protokol, der gør det muligt at knock-out stort set ethvert gen i vanskelige at transfekte celler.
Målet med protokollen, der præsenteres her, er at inducere inaktivering af et gen af interesse i udødeliggjorte muskelceller. Det kan bruges til at knock-out ethvert gen af interesse, i forskellige typer udødeliggjorte celler. Protokollen beskrevet her indeholder trin til at designe guide RNA’erne og deres kloning til lentivirale plasmider, til at producere CRISPR-værktøjerne i lentivirale vektorer, til at transducere cellerne med de forskellige lentivirus og til at klone cellerne for at producere en homogen redigeret cellelinje.
Ved hjælp af denne protokol er udødeliggjorte humane skeletmuskelceller blevet udviklet med deletion af type 1 ryanodinreceptoren (RyR1), en essentiel calciumkanal involveret i intracellulær calciumfrigivelse og muskelkontraktion7. Knock-out (KO) af genet er blevet bekræftet på proteinniveau ved hjælp af Western blot og på det funktionelle niveau ved hjælp af calciumbilleddannelse.
Et stort skridt på vejen til karakterisering af gener med ukendt funktion involveret i patologier er udviklingen af relevante cellulære modeller til at studere funktionen af disse gener. Brugen af genredigering ved hjælp af CRISPR/Cas9 er et eksponentielt voksende forskningsfelt, og udviklingen af knock-out-modeller som præsenteret her er blandt de mest anvendte anvendelser. I denne sammenhæng foreslår vi her en alsidig protokol til at udvikle en human cellelinje knock-out i ethvert gen af interesse, hvilket muligg…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) og fra Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).
Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |