Udvikling af knock-out muskelcellelinjer ved hjælp af Lentivirus-medieret CRISPR / Cas9 genredigering

Summary

Protokollen beskriver, hvordan man genererer knock-out myoblaster ved hjælp af CRISPR/Cas9, startende fra design af guide-RNA’er til den cellulære kloning og karakterisering af knock-out klonerne.

Abstract

En vigtig anvendelse af clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 er udviklingen af knock-out cellelinjer, specifikt for at studere funktionen af nye gener/proteiner forbundet med en sygdom, identificeret under den genetiske diagnose. For udviklingen af sådanne cellelinjer skal to hovedspørgsmål løses: indsættelse af CRISPR-værktøjerne (Cas9 og guide RNA) med høj effektivitet i de valgte celler og begrænsning af Cas9-aktiviteten til den specifikke deletion af det valgte gen. Protokollen beskrevet her er dedikeret til indsættelse af CRISPR-værktøjerne i vanskelige at transfektere celler, såsom muskelceller. Denne protokol er baseret på brugen af lentivirus, produceret med plasmider offentligt tilgængelige, for hvilke alle kloningstrin er beskrevet for at målrette mod et gen af interesse. Kontrollen af Cas9-aktivitet er blevet udført ved hjælp af en tilpasning af et tidligere beskrevet system kaldet KamiCas9, hvor transduktionen af cellerne med et lentivirus, der koder for et guide-RNA rettet mod Cas9, muliggør progressiv afskaffelse af Cas9-ekspression. Denne protokol er blevet anvendt til udviklingen af en RYR1-knock out human muskelcellelinje, som er blevet yderligere karakteriseret på protein- og funktionsniveau, for at bekræfte knockout af denne vigtige calciumkanal involveret i muskel intracellulær calciumfrigivelse og i excitations-sammentrækningskobling. Den procedure, der er beskrevet her, kan let anvendes på andre gener i muskelceller eller i andre vanskelige at transfekte celler og producere værdifulde værktøjer til at studere disse gener i humane celler.

Introduction

Med udviklingen af gensekventering og identifikation af mutationer i gener af ukendte funktioner i et specifikt væv udgør udviklingen af relevante cellulære modeller til at forstå funktionen af et nyt målgen og bekræfte dets involvering i de relaterede patofysiologiske mekanismer et vigtigt redskab. Desuden er disse modeller af stor betydning for den fremtidige terapeutiske udvikling ^1,2 og udgør et interessant alternativ til udviklingen af knock-out dyremodeller i lige linje med de internationale anbefalinger om reduktion af brugen af dyr til forsøg. Genredigering ved hjælp af CRISPR/Cas9 er blandt de mest kraftfulde værktøjer, der i øjeblikket er tilgængelige, hvilket har muliggjort udviklingen af mange knock-out/knock-in-modeller, og målrettet genvalidering ved hjælp af CRISPR/Cas9 er blandt de mest anvendte anvendelser af CRISPR/Cas9³. Succesen med genredigering afhænger af evnen til at introducere CRISPR-værktøjerne (guide RNA’erne og nukleasen Cas9) i målcellemodellen, hvilket kan være en udfordring i mange vanskelige at transfekte celler, såsom muskelceller⁴. Denne udfordring kan overvindes ved brug af virus, normalt lentivirus, som har den store fordel at transducere effektivt mange celletyper og levere dets transgen. Men dens største ulempe er integrationen af transgenet i værtscellegenomet, hvilket fører til potentiel ændring af gener lokaliseret på integrationsstedet og til permanent ekspression af transgenet, hvilket i tilfælde af nukleasen Cas9 ville resultere i skadelige konsekvenser⁵. En smart løsning er blevet foreslået af Merienne og kolleger⁶, som består i introduktion i cellerne af et guide-RNA rettet mod selve Cas9-genet, hvilket fører til Cas9-inaktivering. En tilpasning af denne strategi præsenteres her som en brugervenlig og alsidig protokol, der gør det muligt at knock-out stort set ethvert gen i vanskelige at transfekte celler.

Målet med protokollen, der præsenteres her, er at inducere inaktivering af et gen af interesse i udødeliggjorte muskelceller. Det kan bruges til at knock-out ethvert gen af interesse, i forskellige typer udødeliggjorte celler. Protokollen beskrevet her indeholder trin til at designe guide RNA’erne og deres kloning til lentivirale plasmider, til at producere CRISPR-værktøjerne i lentivirale vektorer, til at transducere cellerne med de forskellige lentivirus og til at klone cellerne for at producere en homogen redigeret cellelinje.

Ved hjælp af denne protokol er udødeliggjorte humane skeletmuskelceller blevet udviklet med deletion af type 1 ryanodinreceptoren (RyR1), en essentiel calciumkanal involveret i intracellulær calciumfrigivelse og muskelkontraktion⁷. Knock-out (KO) af genet er blevet bekræftet på proteinniveau ved hjælp af Western blot og på det funktionelle niveau ved hjælp af calciumbilleddannelse.

Protocol

Muskelbiopsier blev opnået fra Bank of Tissues for Research (Myobank, en partner i EU-netværket EuroBioBank, Paris, Frankrig) i overensstemmelse med europæiske anbefalinger og fransk lovgivning. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle personer. Udødeliggjorte myoblaster blev venligt produceret af Dr. V. Mouly (Myology Institute, Paris, Frankrig), og protokollerne blev godkendt af Myology Institute ethic Committee (MESRI, n AC-2019-3502). 1. CRISPR guide design</str…

Representative Results

Denne protokol blev anvendt på udødeliggjorte myoblaster fra et sundt emne15 (såkaldte HM-celler til humane myoblaster), hvor RyR1 tidligere er blevet karakteriseret16, for at slå RYR1-genet ud, der koder for RyR1-proteinet. Designet af guiderne RNA blev lavet til at slette sekvensen, der omfatter en del af exon 101 og intron 101 af genet. Sletning af en del af exon 101 forventes at resultere i forstyrrelse af læserammen. Derudover koder exon 101 for proteinet…

Discussion

Et stort skridt på vejen til karakterisering af gener med ukendt funktion involveret i patologier er udviklingen af relevante cellulære modeller til at studere funktionen af disse gener. Brugen af genredigering ved hjælp af CRISPR/Cas9 er et eksponentielt voksende forskningsfelt, og udviklingen af knock-out-modeller som præsenteret her er blandt de mest anvendte anvendelser. I denne sammenhæng foreslår vi her en alsidig protokol til at udvikle en human cellelinje knock-out i ethvert gen af interesse, hvilket muligg…

Materials

Anti-CACNA1S antibody	Sigma-Aldrich	HPA048892	Primary antibody
Blp I	NE BioLabs	R0585S	Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit	Takara	631312	Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG	GeneTex	GTX221667-01	HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG	GeneTex	GTX221666	HRP secondary antibody
Fluo-4 direct	Molecular Probes	F10472	Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#2118	Primary antibody
HindIII	Fermentas	ER0501	Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus	Takara	638920	Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC	ThermoFisher Scientific	F532L	Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody	DHSB	MF20	Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	REF 740424	Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609	DNA purification
NucleoSpin Tissue	Macherey-Nagel	740952	Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli	ThermoFisher Scientific	C737303	Chemically competent cells
Plasmid #87904	Addgene	87904	Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919	Addgene	87919	Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260	Addgene	12260	Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454	Addgene	8454	Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody	Invitrogene	R96025	Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	Chemically competent cells
Xma I	NE BioLabs	R0180S	Restriction enzyme