Detta protokoll beskriver en röjningsteknik för risskott, som är svåra att förbereda för interna strukturella observationer på grund av vävnadernas hårda, tjocka eller skiktade natur. Denna metod underlättar kontinuerliga och djupa fluorescensobservationer, även i vuxna risplantor.
Den nyligen utvecklade röjningstekniken som eliminerar brytningsindexmatchningar och minskar autofluorescerande material har gjort det möjligt att observera växtvävnader i tre dimensioner (3D) samtidigt som deras inre strukturer bevaras. I ris (Oryza sativa L.), en monocotmodellväxt och en globalt viktig gröda, har röjningsteknik rapporterats i organ som är relativt lätta att observera, såsom rötter och löv. Tillämpningar av röjningsteknik i skottapiskt meristem (SAM) och stjälkar har också rapporterats, men endast i begränsad utsträckning på grund av den dåliga penetrationen av clearinglösningen (CS) i dessa vävnader. Den begränsade effektiviteten hos clearinglösningarna i dessa vävnader har tillskrivits autofluorescens, förtjockning och härdning av vävnaderna i stammen när kärlbuntarna och epidermis utvecklas och skiktning av SAM med vattenavvisande löv. Detta protokoll rapporterar optimering av en clearingmetod för kontinuerlig och 3D-observation av genuttryck från SAM / ung panikel till basen av skotten under utveckling. Fasta vävnadsprover som uttrycker en fluorescerande proteinreporter trimmades i sektioner med hjälp av en vibrerande mikroskivare. När en lämplig tjocklek uppnåddes applicerades CS. Genom att specifikt rikta in sig på den centrala vävnaden ökade penetrationshastigheten och enhetligheten hos CS och den tid som krävdes för att göra vävnaden transparent minskade. Dessutom möjliggjorde rensning av de trimmade sektionerna observation av den interna strukturen för hela fotograferingen ur ett makroperspektiv. Denna metod har potentiella tillämpningar vid djupavbildning av vävnader från andra växtarter som är svåra att rensa.
Nyligen utvecklad röjningsteknik har gjort det möjligt att observera växternas djupa vävnader samtidigt som deras inre struktur 1,2,3 bevaras. I dikotmodellväxten Arabidopsis har många studier på fluorescerande proteinavbildning utförts med hjälp av clearingteknik för att eliminera brytningsindexmatchningar och avlägsna autofluorescerande material 4,5,6. Även om användningen av clearingteknik7,8 och 3D-avbildning vid cellulär upplösning9 har rapporterats i ris (Oryza sativa L.), en monocotmodellväxt och en globalt viktig gröda, är dessa begränsade till relativt tunna och mjuka organ, såsom rötter, löv och skjuta apikal meristem (SAM), som är lätta att observera.
Skottet är huvudorganet som utgör de ovanjordiska delarna av kärlväxter. I ris består skott av en serie vertikalt staplade “fytomerer”, bestående av axillära knoppar, löv och stammen10. Vid skottets spets består SAM av odifferentierade stamceller i mitten. Fytomerer bildas genom differentiering av celler härledda från SAM. Efter att växterna skiftat från vegetativ till reproduktiv fas förlängs risstammarna och SAM differentieras till unga paniklar10. Denna utvecklingsförändring åtföljs av fluktuationer i uttrycket av olika gener i stjälkarna och SAM / unga paniklar. För att förstå mekanismerna bakom celldifferentiering i olika vävnader är det viktigt att strukturellt observera cellmorfologin och genuttrycket i inre skottvävnader. Den djupa avbildningen av stjälkar (noder och internoder) i skottet utgör emellertid en utmaning på grund av ineffektiviteten i clearinglösningar för att tränga in i vävnaden. Stammar genomgår omedelbart en snabb volymökning från lateral tillväxt efter differentiering från SAM. Härdningen av risnodvävnaderna på grund av förtjockningen av kärlbuntarna och den horisontella komplexa länken i nodal vaskulär anastomos, förutom den höga avstötningen av risskott, bidrar alla till att begränsa penetrationen av CS i stjälkar10.
Denna studie syftade till att observera förändringar i genuttryck i risskottvävnader med hjälp av en strukturell djupfluorescensteknik. Detta arbete optimerar ett clearingprotokoll för ris för att kontinuerligt observera genuttryck från SAM / ung panikel till basen i en 3D-struktur, snarare än på en plan yta, med hjälp av ett konfokalt lasermikroskop.
Kritiska steg i protokollet
De kritiska stegen i detta protokoll är fixering och trimning. Risskott har hårda, tjocka eller skiktade vävnader som begränsar penetrationen av fixeringslösningen. För att förbättra fixeringslösningens permeabilitet rakades ena sidan av vävnaden tunt vid provtagning, vilket visas i figur 1E-F. Dessutom upprepades vakuumbehandlingarna två gånger med högre tryck. Dessutom fixerades proverna över natten till 4 °C i stället för den vanliga 2-timmarsfixeringen vid 4 °C.
Nyckelpunkten i trimningssteget är att bestämma tjockleken på vävnaderna som ska beredas för att observera de fluorescerande proteinerna samtidigt som deras inre struktur bevaras efter en kort period av CS-behandling. Som visas i figur 2C blev de 1 mm tjocka proverna, handtrimmade så tunna som möjligt, transparenta i endast ett begränsat antal vävnader även efter 3 månaders CS-behandling. Därför är trimningssteget viktigt för djupfluorescensobservation av vuxna risskott. I denna studie trimmades proverna till en tjocklek av 130 μm, vilket visas i figur 2D. Tjockleken på 130 μm möjliggjorde för att rensa bladen efter 1 veckas CS-behandling och hela provet efter 2 veckor. Vuxna risskott vid 9-10 LS användes i denna studie. Tjocka men mjukare vävnader från yngre risskott kan rensas snabbare med CS-behandlingen. Provernas tjocklek och varaktigheten av CS-behandlingen bör justeras beroende på vävnadstyp, tillstånd och tjocklek på den 3D-struktur som ska observeras.
Ändringar och felsökningsmetoder
CS fälldes lätt ut vid låga temperaturer. Den utfällda CS kan inte bevara de fluorescerande proteinerna; Därför måste man vara försiktig när proverna förvaras vid rätt temperatur. Dessutom har både CS och fixativ lösning ingen antiseptisk effekt; Därför kommer fluorescerande proteiner att brytas ned om de är förorenade. Jordodlat ris är benäget för svamptillväxt; Därför måste provtagning och hantering av prover utföras med försiktighet för att undvika kontaminering.
Överskott av fluorescerande färgämnen i bufferten kan avge bakgrundsfluorescens och störa mikroskopiska observationer. Till exempel användes tidigare en kalcofluorvit lösning innehållande Evans blått färgämne. Efter färgning i 1 h och tvättning i 1 h observerades de fluorescerande proteinerna i OsMADS15-mOrange med användning av en 555 nm laser. Fluorescerande proteiner kunde emellertid inte observeras på grund av bakgrundsfluorescensen härrörande från Evans blå färgämne. Denna bakgrundsfluorescens eliminerades nästan genom att tvätta proverna i 2 timmar. Dessutom var de fluorescerande proteinerna tydligare om proverna lämnades över natten. Därför användes en ren kalcofluorvit lösning i denna studie. Bakgrundsfluorescens härledd från det fluorescerande färgämnet bör kontrolleras med olika laservåglängder före observationer.
Begränsningar av metoden
Som visas i figur 3 observerades djupa fluorescerande proteiner i proverna som var 130 μm tjocka efter 2 veckors CS-behandling. Detta överensstämmer med resultaten som visas i figur 2D, där det 130 μm tjocka provet blev transparent efter 2 veckors CS-behandling. Som visas i figur 3A var emellertid autofluorescens av cytoplasman fortfarande märkbar i noderna efter 2 veckor och avlägsnades först helt efter 4 veckors CS-behandling. Noder har en hög celldensitet och kräver därför längre tid för att ta bort autofluorescerande material.
Som visas i figur 3C observerades djupa fluorescerande proteiner i bladen utan CS-behandling, men ljusstyrkan var svagare än den i noderna och internoderna på samma djup av 20 μm. Efter 1 veckas CS-behandling var de fluorescerande proteinerna ljusare. Klorofyll är rikligt i löv och absorberar 488 nm excitationsljus. De har också orange / röd autofluorescens, vilket kan störa observationen av fluorescerande proteiner med hjälp av en 555 nm laser. Efter 1 veckas CS-behandling avlägsnades klorofyll och andra autofluorescerande material, vilket resulterade i bilder med högt signal-brusförhållande.
Djupet som kunde observeras i vävnader efter 2 veckor och 4 veckors CS-behandling var inte signifikant annorlunda, även om de fluorescerande proteinerna verkade svagare efter 4 veckor (Figur 3). Normalt försvagas ljusstyrkan hos fluorescerande proteiner och autofluorescens med tiden, vilket resulterar i ett högre signal-brusförhållande. Därför kan fluorescerande proteiner observeras tydligare genom att justera de mikroskopiska förhållandena och bildbehandlingen. Baserat på dessa resultat drogs slutsatsen att 2 veckors CS-behandling kunde underlätta observationen av djupfluorescerande proteiner, med tanke på våra provförhållanden. 4 veckor behövs dock för att observera tydligare bilder som helt utesluter de autofluorescerande materialen.
Strukturer med stark autofluorescens, såsom vaskulära buntar och flerarmsceller, kan inte rensas i CS. För att observera dessa strukturer utan autofluorescens är det nödvändigt att använda en tidsstyrningsmetod12 eller att erhålla bilder genom spektroskopi av fluorescensspektrumet. Ett tvåfotonmikroskop kan vara mer lämpligt för att observera djupare vävnader om tjockare vävnader observeras.
Metodens betydelse i förhållande till befintliga och alternativa metoder
I allmänhet har de inre strukturerna hos risplantor observerats med antingen kryostat eller vibratomsektionering. En kryostat är lämplig för beredning av tunna sektioner, vilket möjliggör enklare observation, men beredningen av proverna och driften av utrustningen är tidskrävande. Att rekonstruera den ursprungliga 3D-strukturen från tunna sektioner är också svårt. Vibratomet är relativt lätt att använda och lämpligt för att producera tjocka sektioner. Tjocka delar av målvävnader tillåter dock endast observationer av den skurna ytan och inte djupa vävnader som ljuset inte kan nå. Av dessa skäl är ingen av metoderna lämplig för observationer av djup fluorescens.
Denna studie behandlade utmaningar i djupfluorescensobservation i risskott, såsom den begränsade vävnadspenetrationen av CS och den dåliga objektupplösningen under ett konfokalmikroskop, genom att kombinera befintliga metoder. Som visas i figur 4 observerade vi fluorescerande proteiner (OsMADS15-mOrange) uttryckta i de djupa vävnaderna hos vuxna risskott från den unga panikeln till basen. Figur 4D fokuserar på floretten och visar djupfluorescerande proteiner med 3 μm intervall. Vävnader över −130 μm djup observerades efter 2 veckors CS-behandling, men endast vävnaderna inom −27 μm djup observerades (data visas inte) i floretten i samma storlek och tillväxtstadium utan CS-behandling. Det nuvarande förbättrade protokollet möjliggjorde observation inte bara av överuttryck av gener utan också naturligt genuttryck i de djupa vävnaderna hos vuxna risskott.
Metodens betydelse och potentiella tillämpningar inom specifika forskningsområden
Detta protokoll, som optimerar djupfluorescensobservationen av vuxna risskott, möjliggör effektiv rensning av hårda, tjocka eller skiktade vävnader genom att trimma bort onödiga vävnader och öka CS permeabilitet. Dessutom optimerades tjockleken på proverna för analys för att möjliggöra kontinuerlig och strukturell djupfluorescensobservation med hjälp av ett konfokalt lasermikroskop, som normalt inte kan lösa tjocka eller ogenomskinliga vävnader.
Det är svårt att jämföra risprover i olika tillväxtstadier eftersom de fluorescerande proteinerna bryts ned med tiden i fixerings- och PBS-lösningarna. De fluorescerande proteinerna i CS kan emellertid lagras i mer än 5 månader1. Cs långa hållbarhet är en stor fördel för observation av djup fluorescens i ris.
Nyligen har många clearingtekniker utvecklats, vilket gör det möjligt att observera djupa vävnader i 3D samtidigt som de bevarar sina interna strukturer. Dessa tekniker har fortsatt att utvecklas och nya clearinglösningar har utvecklats. Ett bra exempel är iTOMEI14, som möjliggör effektiv klorofyllborttagning och ljusare fluorescensdetektion. Ett annat exempel är ClearSeeAlpha15, som förhindrar brunning av vävnader under rensningsbehandling och får dem att se transparenta ut. Genom att kombinera dessa clearinglösningar med den nuvarande metoden kan det bli möjligt att rensa och ändamålsenligare.
Det förväntas att den nuvarande metoden kommer att hjälpa till att få nya insikter genom djup avbildning av inte bara ris utan även andra växter.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. R. Terada, Dr. Z. Shimatani och Dr. H. Tsuji för att de gav oss OsMADS15-mOrange frön; Dr. D. Kurihara för att förse oss med NGCN-konstruktionen; och Dr. R. Shim för redigering av vårt manuskript. Detta arbete finansierades av JSPS KAKENHI (bidragsnummer JP20H05912, 20H05778, 20H05779) och av SATREPS-programmet (nr. JPMJSA1706) från JST och JICA.
1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |