بناء نموذج لخلية عضلية ملساء للشريان الأورطي البشري على رقاقة لتلخيص الإجهاد الميكانيكي الحيوي في جدار الأبهر
Summary
هنا ، قمنا بتطوير نموذج خلية عضلية ملساء للشريان الأورطي البشري على رقاقة لتكرار السلالة الميكانيكية الحيوية في الجسم الحي لخلايا العضلات الملساء في جدار الأبهر البشري.
Abstract
تم استخدام تقنيات زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية والنماذج الحيوانية في دراسة تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري البشري وتسلخه (TAAD). ومع ذلك ، لا يمكن في بعض الأحيان وصف TAAD البشري بالنماذج الحيوانية. هناك فجوة واضحة بين الأنواع بين الدراسات البشرية السريرية والتجارب على الحيوانات التي قد تعيق اكتشاف الأدوية العلاجية. في المقابل ، فإن نموذج زراعة الخلايا التقليدي غير قادر على محاكاة المحفزات الميكانيكية الحيوية في الجسم الحي . تحقيقا لهذه الغاية ، تطورت تقنيات التصنيع الدقيق والموائع الدقيقة بشكل كبير في السنوات الأخيرة ، مما يوفر تقنيات جديدة لإنشاء نماذج عضوية على رقاقة تكرر البيئة المكروية الميكانيكية الحيوية. في هذه الدراسة ، تم تطوير نموذج خلية العضلات الملساء للشريان الأورطي البشري (HASMC-OOC) لمحاكاة المعلمات الفيزيولوجية المرضية للميكانيكا الحيوية الأبهرية ، بما في ذلك سعة وتواتر الإجهاد الدوري الذي تعاني منه خلايا العضلات الملساء الأبهرية البشرية (HASMCs) التي تلعب دورا حيويا في TAAD. في هذا النموذج ، أصبح مورفولوجيا HASMCs ممدودا في الشكل ، ومحاذاة عموديا على اتجاه الإجهاد ، وقدم نمطا ظاهريا أكثر انقباضا في ظل ظروف الإجهاد مقارنة بالظروف التقليدية الساكنة. كان هذا متسقا مع اتجاه الخلية والنمط الظاهري في جدران الأبهر البشرية الأصلية. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام TAAD (BAV-TAAD) المرتبط بالصمام الأبهري ثنائي الشرف و TAAD (TAV-TAAD) الأولي المرتبط بالصمام الأبهري ثلاثي الشرف (TAV-TAAD) HASMCs المشتق من المريض ، أنشأنا نماذج مرض BAV-TAAD و TAV-TAAD ، والتي تكرر خصائص HASMC في TAAD. يوفر نموذج HASMC-OOC منصة جديدة في المختبر مكملة للنماذج الحيوانية لمزيد من استكشاف التسبب في TAAD واكتشاف الأهداف العلاجية.
Introduction
تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري وتسلخه (TAAD) هو توسع موضعي أو تفريغ لجدار الأبهر المرتبط بارتفاع معدلات المراضة والوفيات1. تلعب خلايا العضلات الملساء الأبهرية البشرية (HASMCs) دورا حيويا في التسبب في TAAD. HASMCs ليست خلايا متمايزة نهائيا ، وتحتفظ HASMCs بمرونة عالية ، مما يسمح لها بتبديل الأنماط الظاهرية استجابة للمحفزات المختلفة2. تتعرض HASMCs بشكل أساسي لإجهاد الشد الإيقاعي في الجسم الحي ، وهذا أحد العوامل الرئيسية التي تنظم التغيرات المورفولوجية للعضلات الملساء والتمايز والوظائف الفسيولوجية 3,4. لذلك ، لا يمكن تجاهل دور الإجهاد الدوري في دراسة HASMCs. ومع ذلك ، لا يمكن لمزارع الخلايا التقليدية 2D تكرار التحفيز الميكانيكي الحيوي للسلالة الدورية التي تعاني منها HASMCs في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بناء نموذج TAAD الحيواني غير مناسب لبعض أنواع TAAD ، مثل TAAD المرتبط بالصمام الأبهري ثنائي الشرف (BAV). علاوة على ذلك ، لا يمكن تجاهل فجوة الأنواع بين الدراسات البشرية السريرية والتجارب على الحيوانات. يعيق الترجمة الصيدلانية في الممارسة السريرية. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لأنظمة أكثر تعقيدا وفسيولوجية لمحاكاة البيئة الميكانيكية الحيوية في الجسم الحي في البحث عن أمراض الأبهر.
التجارب على الحيوانات المستخدمة في البحوث الطبية الحيوية وتطوير الأدوية مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ومشكوك فيها أخلاقيا. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تفشل نتائج الدراسات على الحيوانات في التنبؤ بالنتائج التي تم الحصول عليها في التجارب السريرية البشرية 5,6. أدى عدم وجود نماذج بشرية قبل السريرية وارتفاع معدل الفشل في التجارب السريرية إلى عدد قليل من الأدوية الفعالة للعيادة ، مما أدى إلى زيادة تكاليف الرعاية الصحية7. وبالتالي ، من الضروري إيجاد نماذج تجريبية أخرى لاستكمال النماذج الحيوانية. تطورت تقنيات التصنيع الدقيق والموائع الدقيقة بشكل كبير في السنوات الأخيرة ، مما يوفر تقنيات جديدة لإنشاء نماذج عضوية على رقاقة تعالج عيوب تقنيات زراعة الخلايا التقليدية 2D وإنشاء نموذج أكثر واقعية ومنخفض التكلفة وفعال في المختبر للدراسات الفسيولوجية وتطوير الأدوية. باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة ، يتم إنشاء أعضاء على رقائق لزراعة الخلايا الحية في غرف بحجم ميكرومتر مع محفزات مختلفة لتكرار الوظائف الرئيسية للنسيج أو العضو. يتكون النظام من قنوات دقيقة مفردة أو متعددة من الموائع الدقيقة ، مع نوع واحد من الخلايا المستزرعة في غرفة منخرطة تكرر وظائف نوع واحد من الأنسجة أو أنواع خلايا مختلفة مستزرعة على أغشية مسامية لإعادة إنشاء واجهات بين الأنسجة المختلفة. تتمتع الكائنات العضوية القائمة على الموائع الدقيقة جنبا إلى جنب مع الخلايا المشتقة من المريض بميزة فريدة تتمثل في سد الفرق الكبير بين الأنواع الكبيرة بين نماذج أمراض الفئران والبشر والتغلب على عيوب زراعة الخلايا التقليدية 2D لأبحاث آلية المرض واكتشاف الأدوية. مع التطور السريع للموائع الدقيقة في السنوات القليلة الماضية ، أدرك الباحثون فائدة نماذج الأعضاء على الرقاقة في المختبر (OOC) التي تكرر المعلمات البيولوجية المعقدة في الجسم الحي 8. تحاكي هذه الكائنات العضوية الموائع الدقيقة البيئات الميكانيكية الحيوية في المختبر ، مثل الإجهاد الدوري ، وإجهاد القص ، وضغط السائل ، مما يوفر بيئة زراعة خلايا ثلاثية الأبعاد (3D). حتى الآن ، تم إنشاء العديد من نماذج OOC لمحاكاة المحفزات الميكانيكية الحيوية في أعضاء مثل الرئة9 والكلى 10 والكبد 11 والأمعاء12 والقلب 13 ، ولكن لم يتم تطبيقها على نطاق واسع لدراسة مرض الأبهر البشري.
في هذه الدراسة ، نقدم نموذج خلية عضلية ملساء للشريان الأورطي البشري (HASMC-OOC) يمكنه التحكم في القوى الميكانيكية الحيوية والإيقاعات المطبقة على HASMCs الأولية المشتقة من المريض TAAD. تتكون الشريحة من ألواح سميكة ثلاثية الطبقات من polydimethylsiloxane (PDMS) محفورة بقنوات واثنين من أغشية PDMS عالية المرونة التجارية. يتم استزراع HASMCs على أغشية PDMS. تمتلئ القناة الموجودة في منتصف الشريحة بوسط ثقافة لزراعة الخلايا. يتم توصيل القنوات العلوية والسفلية للرقاقة بنظام إمداد ضغط الفراغ الذي يمكنه التحكم في إيقاع وتواتر إجهاد الشد الميكانيكي لأغشية PDMS. يمكن محاكاة الإجهاد الإيقاعي الذي تعاني منه HASMCs في HASMC-OOC ، وتكرار البيئة المكروية الميكانيكية الحيوية للأنسجة أو الأعضاء التي لا يمكن تحقيقها وظيفيا باستخدام أنظمة الثقافة التقليدية 2D. مع الاستفادة من التصوير عالي الدقة ، في الوقت الحقيقي ، والبيئة الدقيقة الميكانيكية الحيوية ، يمكن دراسة الأنشطة البيوكيميائية والجينية والأيضية للخلايا الحية لتطوير الأنسجة ، وفسيولوجيا الأعضاء ، ومسببات الأمراض ، والآليات الجزيئية وتحديد العلامات الحيوية ، وأمراض القلب والأوعية الدموية وأمراض الأبهر. إلى جانب الخلايا الخاصة بالأنسجة والمريض ، يمكن استخدام هذا النظام لفحص الأدوية والطب الشخصي واختبار السمية. يوفر نموذج HASMC-OOC هذا منصة جديدة في المختبر لدراسة التسبب في مرض الأبهر.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع التطور السريع لتكنولوجيا الموائع الدقيقة ، ظهرت نماذج OOC التي يمكنها تكرار الوظيفة البيولوجية وهيكل واحد أو أكثر من الأعضاء في المختبر في السنوات الأخيرة للتطبيقات في علم الأحياء والطب وعلم الأدوية15. يمكن ل OOC محاكاة الوظائف الرئيسية للبيئة المكروية الفسيولوجية البش…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بأن هذا العمل كان مدعوما بمنح من لجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (20ZR1411700) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81771971) ، وبرنامج شنغهاي للإبحار (22YF1406600).
Materials
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
Referências
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow – application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
