In vitro-val av aptamerer för att skilja infektiösa från icke-infektiösa virus

Summary

Vi tillhandahåller ett protokoll som generellt kan tillämpas på utvalda aptamerer som endast binder till infektiösa virus och inte till virus som har gjorts icke-infektiösa genom en desinfektionsmetod eller till andra liknande virus. Detta gör det möjligt att fastställa smittsamhetsstatus i bärbara tester och snabbtester.

Abstract

Virusinfektioner har stor inverkan på samhället; De flesta detektionsmetoder har svårt att avgöra om ett upptäckt virus är smittsamt, vilket orsakar förseningar i behandlingen och ytterligare spridning av viruset. Att utveckla nya sensorer som kan informera om smittbarheten hos kliniska eller miljömässiga prover kommer att möta denna ouppfyllda utmaning. Men mycket få metoder kan få avkänningsmolekyler som kan känna igen ett intakt infektiöst virus och skilja det från samma virus som har gjorts icke-infektiöst genom desinfektionsmetoder. Här beskriver vi ett protokoll för att välja aptamerer som kan skilja infektiösa virus mot icke-infektiösa virus med hjälp av systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning (SELEX). Vi drar nytta av två funktioner i SELEX. För det första kan SELEX skräddarsys för att ta bort konkurrerande mål, såsom icke-infektiösa virus eller andra liknande virus, med hjälp av räknarval. Dessutom kan hela viruset användas som mål för SELEX, istället för till exempel ett viralt ytprotein. Hela viruset SELEX möjliggör val av aptamerer som binder specifikt till virusets ursprungliga tillstånd, utan att viruset behöver störas. Denna metod gör det således möjligt att erhålla igenkänningsmedel baserat på funktionella skillnader i patogenernas yta, som inte behöver vara kända i förväg.

Introduction

Virusinfektioner har enorma ekonomiska och samhälleliga effekter runt om i världen, vilket blev alltmer uppenbart från den senaste COVID-19-pandemin. Snabb och korrekt diagnos är avgörande för att behandla virusinfektioner samtidigt som man förhindrar spridning av virus till friska människor. Medan många virusdetekteringsmetoder har utvecklats, såsom PCR-tester^1,2 och inmunoassays^3, kan de flesta av de för närvarande använda metoderna inte avgöra om det upptäckta viruset faktiskt är infektiöst eller inte. Detta beror på att närvaron av komponenter av viruset ensamt, såsom viral nukleinsyra eller proteiner, inte indikerar att det intakta, infektiösa viruset är närvarande, och nivåer av dessa biomarkörer har visat dålig korrelation med infektivitet ^4,5,6. Till exempel har viralt RNA, som vanligtvis används för de nuvarande PCR-baserade COVID-19-testerna, mycket låga nivåer i de tidiga stadierna av infektion när patienten är smittsam, medan RNA-nivån ofta fortfarande är mycket hög när patienter har återhämtat sig från infektionen och inte längre är smittsamma ^7,8. De virala protein- eller antigenbiomarkörerna följer en liknande trend, men uppträder vanligtvis ännu senare än viralt RNA och är därför ännu mindre prediktiva för infektionsförmåga ^6,9. För att hantera denna begränsning har vissa metoder som kan informera om virusets infektionsstatus utvecklats, men är baserade på cellodlingsmikrobiologiska tekniker som kräver lång tid (dagar eller veckor) för att få resultat ^4,10. Genom att utveckla nya sensorer som kan informera om smittbarheten hos kliniska prover eller miljöprover kan man undvika förseningar i behandlingen och ytterligare spridning av viruset. Men mycket få metoder kan få avkänningsmolekyler som kan känna igen en intakt infektiös virion och skilja den från samma virus som har gjorts icke-infektiös.

I detta sammanhang är aptamerer särskilt väl lämpade som ett unikt biomolekylärt verktyg^11,12,13,14. Aptamerer är korta, enkelsträngade DNA- eller RNA-molekyler med en specifik nukleotidsekvens som gör att de kan bilda en specifik 3D-konformation för att känna igen ett mål med hög affinitet och selektivitet^15,16. De erhålls genom en kombinatorisk urvalsprocess som kallas systematisk evolution av ligander genom exponentiell anrikning (SELEX), även känd som in vitro-selektion, som utförs i provrör med ett stort slumpmässigt DNA-provtagningsbibliotek med 10 14-10 15 sekvenser^17,18,19. I varje omgång av denna iterativa process utsätts DNA-poolen först för ett selektionstryck genom inkubation med målet under önskade förhållanden. Alla sekvenser som inte är bundna till målet tas sedan bort och lämnar bara de få sekvenser som kan binda under de givna förhållandena. Slutligen förstärks sekvenserna som har valts i föregående steg med PCR, vilket berikar poolens population med önskade funktionella sekvenser för nästa urvalsomgång och processen upprepas. När urvalspoolens aktivitet når en platå (vanligtvis efter 8-15 omgångar) analyseras biblioteket genom DNA-sekvensering för att identifiera de vinnande sekvenserna som uppvisar den högsta affiniteten.

SELEX har unika fördelar som kan utnyttjas för att få ökad selektivitet mot andra liknande mål^20,21, t.ex. för virusets infektionsstatus ²². För det första kan en mängd olika typer av mål användas för urvalet, från små molekyler och proteiner till hela patogener och celler¹⁶. Således, för att erhålla en aptamer som binder till ett infektiöst virus, kan ett intakt virus användas som mål, istället för ett viralt ytprotein¹⁹. Hela viruset SELEX möjliggör val av aptamerer som binder specifikt till virusets ursprungliga tillstånd, utan behov av störning av viruset. För det andra kan SELEX skräddarsys för att avlägsna konkurrerande mål 21,23, såsom andra liknande virus eller icke-infektiösa inaktiverade virus^, med hjälp av räknarurvalssteg i varje urvalsomgång²². Under räknarvalsstegen exponeras DNA-poolen för mål för vilka bindning inte önskas, och alla sekvenser som binder kasseras.

I detta arbete tillhandahåller vi ett protokoll som generellt kan tillämpas för att välja aptamerer som binder till ett infektiöst virus men inte till samma virus som har gjorts icke-infektiöst av en viss desinfektionsmetod eller till ett annat relaterat virus. Denna metod gör det möjligt att erhålla igenkänningsmedel baserat på funktionella skillnader i virusytan, som inte behöver vara kända i förväg, och erbjuder därför en ytterligare fördel för detektion av nyligen uppkomna patogener eller för understuderade sjukdomar.

Protocol

1. Beredning av reagens och buffertar Förbered 10x Tris-borat EDTA (10x TBE) genom att tillsätta 0,9 M Tris-bas, 0,9 M borsyra, 20 mM EDTA (dinatriumsalt) och avjoniserat vatten till en slutlig volym på 1 liter. Blanda tills alla komponenter är upplösta. Bered en 10-procentig denaturerande polyakrylamidstamlösning enligt följande. Tillsätt 120 g urea (8 M), 25 ml 10x TBE, 62,5 ml 40% akrylamid / bisakrylamid (29: 1) lösning i en 250 ml glasflaska, och tillräckligt med destil…

Representative Results

Eftersom DNA-aptamerer kan erhållas med hjälp av SELEX i ett provrör15, utformades denna SELEX-strategi noggrant för att inkludera både positiva selektionssteg mot det intakta, hela infektiösa viruset (dvs. behålla DNA-molekylerna som binder till det infektiösa viruset), samt motselektionssteg för samma virus som har gjorts icke-infektiöst med en viss desinfektionsmetod, specifikt UV-behandling, genom att kassera de DNA-sekvenser som kan binda till det icke-infektiösa viruset. En schem…

Discussion

SELEX möjliggör inte bara identifiering av aptamerer med hög affinitet, i pM-nM-intervallet 22,43,44,45^, utan också med hög och avstämbar selektivitet. Genom att dra nytta av räknarval kan aptamerer med utmanande selektivitet erhållas. Till exempel har Li-gruppen visat förmågan att erhålla sekvenser som kan skilja patogena bakteriestammar från icke-patogena stammar<sup class="xref"…

Materials

10% Ammonium persulfate (APS)	BioRad	1610700
100% Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
1x PBS without calcium & magnesium	Corning	21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution	BioRad	1610146
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	DNA clean-up beads – Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merck	UFC501024	cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merck	UFC510024	cut-off 100 kDa
Boric Acid	Sigma-Aldrich	100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module	BioRad	1851148
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters	Thermo Scientific	88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Thermo Fisher	65001	streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9
EDTA disodium salt	Sigma-Aldrich	324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661	1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit	Takara Bio USA, Inc.	632200	Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube	Thermo Scientific	MR02
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	BioRad	MSB1001	non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels	BioRad	1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates	BioRad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers	BioRad	1653310
Molecular Biology Grade Water	Lonza	51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear	BioRad	MLP9611
Nanodrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase	New England BioLab	M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI	Tecan	0344NB-A01	High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL)	Gilson	F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets	Labconco	4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32850	fluorescence-based  dsDNA quantification  kit – Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)	Thomas Scientific	1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002440
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	1725201	qPCR mastermix – Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8	USA scientific	AB1183	PCR tubes
Urea	Sigma-Aldrich	U5128