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Bioengenharia

Selección in vitro de aptámeros para diferenciar virus infecciosos de virus no infecciosos

Published: September 07, 2022
doi:
10.3791/64127
, , ,
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry,University of Texas at Austin

Summary

Proporcionamos un protocolo que generalmente se puede aplicar para seleccionar aptámeros que se unen solo a virus infecciosos y no a virus que se han vuelto no infecciosos mediante un método de desinfección o a cualquier otro virus similar. Esto abre la posibilidad de determinar el estado de infectividad en pruebas portátiles y rápidas.

Abstract

Las infecciones por virus tienen un gran impacto en la sociedad; La mayoría de los métodos de detección tienen dificultades para determinar si un virus detectado es infeccioso, lo que provoca retrasos en el tratamiento y una mayor propagación del virus. El desarrollo de nuevos sensores que puedan informar sobre la infectabilidad de muestras clínicas o ambientales enfrentará este desafío no cumplido. Sin embargo, muy pocos métodos pueden obtener moléculas de detección que puedan reconocer un virus infeccioso intacto y diferenciarlo del mismo virus que se ha vuelto no inactivo por métodos de desinfección. Aquí, describimos un protocolo para seleccionar aptámeros que puedan distinguir virus infecciosos de virus no infecciosos utilizando la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX). Aprovechamos dos características de SELEX. En primer lugar, SELEX se puede hacer a medida para eliminar objetivos competidores, como virus no infecciosos u otros virus similares, utilizando la selección de contadores. Además, todo el virus se puede utilizar como objetivo de SELEX, en lugar de, por ejemplo, una proteína de superficie viral. Virus completo SELEX permite la selección de aptámeros que se unen específicamente al estado nativo del virus, sin la necesidad de interrumpir el virus. Por lo tanto, este método permite obtener agentes de reconocimiento basados en diferencias funcionales en la superficie de los patógenos, que no necesitan ser conocidas de antemano.

Introduction

Las infecciones por virus tienen enormes impactos económicos y sociales en todo el mundo, como se hizo cada vez más evidente a partir de la reciente pandemia de COVID-19. El diagnóstico oportuno y preciso es primordial en el tratamiento de infecciones virales y al mismo tiempo previene la propagación de virus a personas sanas. Si bien se han desarrollado muchos métodos de detección de virus, como las pruebas de PCR1,2 y los inmunoensayos3, la mayoría de los métodos utilizados actualmente no son capaces de determinar si el virus detectado es realmente infeccioso o no. Esto se debe a que la presencia de componentes del virus solos, como el ácido nucleico viral o las proteínas, no indica que el virus infeccioso intacto esté presente, y los niveles de estos biomarcadores han mostrado una correlación deficiente con la infectividad 4,5,6. Por ejemplo, el ARN viral, comúnmente utilizado para las pruebas actuales de COVID-19 basadas en PCR, tiene niveles muy bajos en las primeras etapas de la infección cuando el paciente es contagioso, mientras que el nivel de ARN a menudo sigue siendo muy alto cuando los pacientes se han recuperado de la infección y ya no son contagiosos 7,8. Los biomarcadores de proteínas o antígenos virales siguen una tendencia similar, pero típicamente aparecen incluso más tarde que el ARN viral y, por lo tanto, son aún menos predictivos de infectabilidad 6,9. Para abordar esta limitación, se han desarrollado algunos métodos que pueden informar sobre el estado de infectividad del virus, pero se basan en técnicas de microbiología de cultivos celulares que requieren mucho tiempo (días o semanas) para obtener resultados 4,10. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos sensores que puedan informar sobre la infectabilidad de las muestras clínicas o ambientales puede evitar retrasos en el tratamiento y una mayor propagación del virus. Sin embargo, muy pocos métodos pueden obtener moléculas de detección que puedan reconocer un virión infeccioso intacto y diferenciarlo del mismo virus que se ha vuelto no infeccioso.

En este contexto, los aptámeros son particularmente adecuados como una herramienta biomolecular única11,12,13,14. Los aptámeros son moléculas cortas de ADN o ARN monocatenario con una secuencia específica de nucleótidos que les permite formar una conformación 3D específica para reconocer un objetivo con alta afinidad y selectividad15,16. Se obtienen mediante un proceso de selección combinatoria denominado evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX), también conocido como selección in vitro, que se lleva a cabo en tubos de ensayo con una gran biblioteca de muestreo aleatorio de ADN de 10 14-10 15 secuencias17,18,19. En cada ronda de este proceso iterativo, el conjunto de ADN se somete primero a una presión de selección a través de la incubación con el objetivo en las condiciones deseadas. Cualquier secuencia que no esté unida al objetivo se elimina, dejando atrás solo aquellas pocas secuencias que pueden unirse en las condiciones dadas. Finalmente, las secuencias que se han seleccionado en el paso anterior se amplifican mediante PCR, enriqueciendo la población del pool con las secuencias funcionales deseadas para la siguiente ronda de selección, y se repite el proceso. Cuando la actividad del grupo de selección alcanza una meseta (generalmente después de 8-15 rondas), la biblioteca se analiza mediante secuenciación de ADN para identificar las secuencias ganadoras que exhiben la mayor afinidad.

SELEX tiene ventajas únicas que pueden ser explotadas para obtener una mayor selectividad contra otros objetivos similares20,21, como el estado de infectividad del virus 22. En primer lugar, se puede utilizar una amplia variedad de diferentes tipos de dianas para la selección, desde pequeñas moléculas y proteínas hasta patógenos y células enteras16. Por lo tanto, para obtener un aptámero que se une a un virus infeccioso, se puede usar un virus intacto como objetivo, en lugar de una proteína de superficie viral19. Virus completo SELEX permite la selección de aptámeros que se unen específicamente al estado nativo del virus, sin necesidad de interrumpir el virus. En segundo lugar, SELEX puede fabricarse a medida para eliminar objetivos competidores 21,23, como otros virus similares o virus inactivos no infecciosos, utilizando pasos de contraselección en cada ronda de selección22. Durante los pasos de contraselección, el grupo de ADN se expone a objetivos para los que no se desea la unión, y cualquier secuencia que se una se descarta.

En este trabajo, proporcionamos un protocolo que generalmente se puede aplicar para seleccionar aptámeros que se unen a un virus infeccioso pero no al mismo virus que se ha vuelto no infeccioso por un método de desinfección particular o a otros virus relacionados. Este método permite obtener agentes de reconocimiento en función de las diferencias funcionales de la superficie del virus, que no necesitan ser conocidas de antemano, por lo que ofrece una ventaja adicional para la detección de patógenos recién emergidos o para enfermedades poco estudiadas.

Protocol

1. Preparación de reactivos y tampones Prepare 10x Tris-borrate EDTA (10x TBE) agregando 0.9 M Tris-base, 0.9 M de ácido bórico, 20 mM EDTA (sal disódica) y agua desionizada a un volumen final de 1 L. Mezcle hasta que todos los componentes se disuelvan. Prepare una solución madre de poliacrilamida desnaturalizante al 10% de la siguiente manera. En una botella de vidrio de 250 ml, agregue 120 g de urea (8 M), 25 ml de 10x TBE, 62.5 ml de solución de acrilamida/bisacrilamida al 40…

Representative Results

Dado que los aptámeros de ADN se pueden obtener utilizando SELEX en un tubo de ensayo15, esta estrategia de SELEX fue cuidadosamente diseñada para incluir pasos de selección positiva hacia el virus infeccioso intacto y completo (es decir, retener las moléculas de ADN que se unen al virus infeccioso), así como pasos de contraselección para el mismo virus que se ha vuelto no infeccioso por un método de desinfección particular. específicamente el tratamiento UV, descartando las secuencias d…

Discussion

SELEX permite no sólo la identificación de aptámeros con alta afinidad, en el rango pM-nM 22,43,44,45, sino también con alta y sintonizable selectividad. Al aprovechar la contraselección, se pueden obtener aptámeros con selectividad desafiante. Por ejemplo, el grupo Li ha demostrado la capacidad de obtener secuencias que pueden diferenciar cepas bacterianas patógenas de cepas no patóge…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Laura M. Cooper y al Dr. Lijun Rong de la Universidad de Illinois en Chicago por proporcionar las muestras de pseudovirus utilizadas en este protocolo (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), así como al Dr. Álvaro Hernández y al Dr. Chris Wright de la instalación de Servicios de ADN del Centro de Biotecnología Roy J. Carver de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign por su asistencia con la secuenciación de alto rendimiento, y muchos miembros del grupo Lu que nos han ayudado con la selección in vitro y las técnicas de caracterización de aptámeros. Este trabajo fue apoyado por una subvención RAPID de la National Science Foundation (CBET 20-29215) y una subvención inicial del Instituto de Sostenibilidad, Energía y Medio Ambiente de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign e Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. agradece a la PEW Latin American Fellowship por su apoyo financiero. También agradecemos a la Fundación Robert A. Welch (Subvención F-0020) por el apoyo al programa de investigación del grupo Lu en la Universidad de Texas en Austin.

Materials

10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads – Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit – Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix – Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

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Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).
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