Grundlæggende om histologi og påvisning af celledød i honningbivæv
Summary
Immunohistokemiske metoder er nyttige i honningbiforskning til at detektere og vurdere niveauet af apoptose og nekrose i midgut og hypopharyngeal kirtler hos voksne bier.
Abstract
Honningbier (Apis mellifera L.) inde i bikuben (sygeplejerskearbejdere og andre bikuber) og uden for bikuben (foragere) udsættes for klima- og vejrændringer, forskellige pesticider, patogener og underernæring, der hovedsageligt kommer ind gennem munden og primært påvirker fordøjelseskanalen hos voksne bier. For at forstå og forhindre virkningerne af sådanne eksterne og interne stressfaktorer på honningbier er en nyttig forskningsmetode den immunohistokemiske metode. En grundlæggende protokol er beskrevet for at forberede midgut (ventriculus) og hypopharyngeal kirtler (HPG’er) hos voksne bier til histologisk analyse. En detaljeret metode er beskrevet for at vurdere niveauet af celleskader og skelne nekrose fra programmeret celledød (apoptose) som en naturlig proces med vævsregenerering. Resultaterne af behandling af voksne honningbier med oxalsyre og pesticider (insekticid og acaricid) og bestemmelse af celledød i ventriculus og HPG’er præsenteres. Fordele og ulemper ved metoden diskuteres også.
Introduction
Honningbier (Apis mellifera L.) er blandt andre vilde bestøvere de vigtigste bestøvere af landbrugsplanter. I løbet af tusinder af år har det skiftende miljø påvirket bier til at tilpasse deres morfologi, fysiologi, adfærd og tolerance til flere patogener og parasitter. Derfor har honningbier udviklet en meget forskelligartet vifte af arter og underarter rundt om i verden1. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere fund, at der er genetisk variation i honningbiens fordøjelseskanalstruktur, men tyder også på, at ændringer af midgut skyldes miljøfaktorer 2,3.
Honningbiens fordøjelseskanal har tre hoveddele: foregut, midgut (ventriculus) og hindgut4. Ventriculus er et vigtigt organ til fordøjelsen af pollen og nektar / honning; I bagkroppen foregår osmotisk kontrol gennem absorption af vand og ioner2. Hypopharyngeal kirtler (HPG’er) af honningbiarbejdere er placeret i hovedet og syntetiserer og udskiller kongelige gelékomponenter til at fodre bøden, dronningen og medlemmer af kolonien. Deres størrelse ændres med alder og opgaver og afhænger af korrekt ernæring (kvalitetspollen). Sygeplejersker i alderen 6 til 18 dage udfører yngelopdræt, og størrelsen på HPG’er stiger 5,6. I foragerbier degenererer HPG’erne og udskiller kun enzymer, der er vigtige for at omdanne de komplekse sukkerarter til enkle (α-glucosidaser, leucin arylamidase, invertase) i honning7.
Honningbier udsættes for flere biotiske og abiotiske stressfaktorer8, og fordøjelseskanalen kan påvirkes af flere negative stimulanser. Den første barriere, der beskytter organismen mod patogener, er den peritrofiske membran i midgut, som består af tarmslimhinden for at beskytte mod patogener4. Udviklingen og funktionen af HPG’er afhænger af kost, alder og kolonitilstand9 og påvirkes af insekticider, acaricider 10 og patogener11,12,13. Acaricide rester i bikuben på grund af varroa kontrol behandling og pesticider fra miljøet påvirker forager bier og sygeplejerske bier14,15. Den største trussel mod honningbikolonier er miden Varroa destructor, både som vektor af vira, der bidrager til kolonitab16 og som forbruger af værtens fedtlegeme (et vigtigt vitalt organ i honningbier), som følgelig påvirker individets krops- og kolonifunktioner17.
Imidlertid kan intensive landbrugsjordhabitater give en kortsigtet fødevareforsyning til honningbier. Derfor bør miljøvenlige landbrugsordninger øge tilgængeligheden af honningblomster i landbrugslandskaber18. For at vurdere morfologien af forskellige underarter 6,19,20,21 eller subletale virkninger af disse faktorer på celle- eller vævsniveau, især midgut og HPG’er, er histologiske og immunohistokemiske metoder praktiske og tilstrækkeligt nøjagtige til at blive anvendt i histologisk forskning i honningbier.
Protocol
Representative Results
Discussion
I levende organismer defineres celledød som apoptose eller nekrose25 og kan ledsages af autofagi26. Forskellen mellem apoptotiske og nekrotiske celler er, at apoptose er en form for programmeret celledød og forekommer i normale celler, mens nekrose opstår på grund af dødelige tilstande (f.eks. ulykke, sygdom)27,28. Apoptose kan detekteres ved hjælp af assaysæt baseret på TUNEL-teknikken (påvisning afDNA-fra…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jeg anerkender taknemmeligt støtten fra det slovenske forskningsagentur, bevilling nr. P4-133.
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
Referências
- Ruttner, F. . Naturgeschichte der Honigbienen. , (1992).
- Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. . The Anatomy of the Honey Bee. , (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. . Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M. Honey bee toxicology. Annual Review of Entomology. 60 (1), 415-434 (2005).
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, &. #. 2. 1. 4. ;. Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. . Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D’Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
