Histologie Basics en celdooddetectie in honingbijenweefsel
Summary
Immunohistochemische methoden zijn nuttig in honingbijenonderzoek om het niveau van apoptose en necrose in de midgut- en hypofaryngeale klieren van volwassen bijen te detecteren en te beoordelen.
Abstract
Honingbijen (Apis mellifera L.) in de korf (verpleegsters en andere bijenkorfbijen) en buiten de korf (foerageerders) worden blootgesteld aan klimaat- en weersveranderingen, verschillende pesticiden, pathogenen en ondervoeding, voornamelijk via de mond en voornamelijk van invloed op het spijsverteringskanaal van volwassen bijen. Om de effecten van dergelijke externe en interne stressoren op honingbijen te begrijpen en te voorkomen, is een nuttige onderzoeksmethode de immunohistochemische methode. Een basisprotocol wordt beschreven om de midgut (ventriculus) en hypofaryngeale klieren (HPG’s) van volwassen bijen voor te bereiden op histologische analyse. Een gedetailleerde methodologie wordt beschreven om het niveau van celbeschadiging te beoordelen en necrose te onderscheiden van geprogrammeerde celdood (apoptose) als een natuurlijk proces van weefselregeneratie. De resultaten van volwassen honingbijenbehandeling met oxaalzuur en pesticiden (insecticide en acaricide) en de bepaling van celdood in de ventriculus en HPG’s worden gepresenteerd. Ook de voor- en nadelen van de methodiek komen aan bod.
Introduction
Honingbijen (Apis mellifera L.) zijn, naast andere wilde bestuivers, de belangrijkste bestuivers van landbouwgewassen. Gedurende duizenden jaren heeft de veranderende omgeving bijen beïnvloed om hun morfologie, fysiologie, gedrag en tolerantie aan te passen aan verschillende pathogenen en parasieten. Daarom hebben honingbijen een zeer divers scala aan soorten en ondersoorten over de hele wereld ontwikkeld1. Deze resultaten komen overeen met eerdere bevindingen, dat er genetische variatie is in de structuur van het spijsverteringskanaal van de honingbij, maar suggereren ook dat veranderingen van het midgut te wijten zijn aan omgevingsfactoren 2,3.
Het spijsverteringskanaal van de honingbij bestaat uit drie hoofdonderdelen: foregut, midgut (ventriculus) en hindgut4. De ventriculus is een essentieel orgaan voor de vertering van stuifmeel en nectar/honing; in het achterbeen vindt osmotische controle plaats door absorptie van water en ionen2. De hypofaryngeale klieren (HPG’s) van honingbijwerkers bevinden zich in het hoofd en synthetiseren en scheiden koninginnengeleicomponenten af om het broed, de koningin en leden van de kolonie te voeden. Hun grootte verandert met leeftijd en taken en is afhankelijk van de juiste voeding (kwaliteit stuifmeel). Verpleegsters van 6 tot 18 dagen voeren broedopfok uit en de grootte van HPG’s neemttoe met 5,6. Bij foerageerbijen degenereren de HPG’s en scheiden ze alleen enzymen af die belangrijk zijn om de complexe suikers om te zetten in eenvoudige (α-glucosidases, leucine arylamidase, invertase) in honing7.
Honingbijen worden blootgesteld aan verschillende biotische en abiotische stressoren8, en het spijsverteringskanaal kan worden beïnvloed door verschillende negatieve stimulerende middelen. De eerste barrière die het organisme beschermt tegen pathogenen is het peritrofe membraan in het midgut, dat bestaat uit darmslijmvlies om te beschermen tegen pathogenen4. De ontwikkeling en functie van HPG’s zijn afhankelijk van dieet, leeftijd en kolonieconditie9 en worden beïnvloed door insecticiden, acariciden10 en pathogenen 11,12,13. Acaricideresiduen in de korf als gevolg van varroabestrijding en pesticiden uit het milieu beïnvloeden foerageerbijen en verpleegbijen14,15. De grootste bedreiging voor honingbijenkolonies is de mijt Varroa-destructor, zowel als vector van virussen die bijdragen aan kolonieverliezen16 als als consument van het vetlichaam van de gastheer (een belangrijk vitaal orgaan in honingbijen), wat bijgevolg het lichaam en de koloniefuncties van het individu beïnvloedt17.
Intensieve landbouwgrondhabitats kunnen echter op korte termijn zorgen voor een voedselvoorziening voor honingbijen. Daarom moeten agromilieuregelingen de beschikbaarheid van honingbloemen in landbouwlandschappen vergroten18. Om de morfologie van verschillende ondersoorten 6,19,20,21 of subletale effecten van deze factoren op cel- of weefselniveau, met name midgut en HPG’s, te beoordelen, zijn histologische en immunohistochemische methoden praktisch en voldoende nauwkeurig om te worden gebruikt in histologisch onderzoek bij honingbijen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In levende organismen wordt celdood gedefinieerd als apoptose of necrose25 en kan gepaard gaan met autofagie26. Het verschil tussen apoptotische en necrotische cellen is dat apoptose een vorm van geprogrammeerde celdood is en voorkomt in normale cellen, terwijl necrose optreedt als gevolg van dodelijke aandoeningen (bijv. Ongeval, ziekte)27,28. Apoptose kan worden gedetecteerd met behulp van testkits op basis van de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ik dank de steun van het Sloveense onderzoeksbureau, subsidie nr. P4-133.
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
Referências
- Ruttner, F. . Naturgeschichte der Honigbienen. , (1992).
- Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. . The Anatomy of the Honey Bee. , (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. . Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M. Honey bee toxicology. Annual Review of Entomology. 60 (1), 415-434 (2005).
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, &. #. 2. 1. 4. ;. Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. . Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D’Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
