꿀벌 조직의 조직학 기초 및 세포 사멸 검출
Summary
면역 조직 화학적 방법은 꿀벌 연구에서 성인 꿀벌의 중추 및 하인두 땀샘에서 세포 사멸 및 괴사 수준을 감지하고 평가하는 데 유용합니다.
Abstract
꿀벌 (Apis mellifera L.) 벌집 내부 (간호사 및 기타 벌집 꿀벌)와 벌집 외부 (채집자)는 기후 및 날씨 변화, 다양한 살충제, 병원균 및 영양 실조에 노출되며 주로 입을 통해 들어가고 주로 성인 꿀벌의 소화관에 영향을 미칩니다. 꿀벌에 대한 이러한 외부 및 내부 스트레스 요인의 영향을 이해하고 예방하기 위해 유용한 연구 방법 중 하나는 면역 조직 화학적 방법입니다. 조직 학적 분석을 위해 성인 꿀벌의 중추 (심실) 및 하인두 땀샘 (HPG)을 준비하기위한 기본 프로토콜이 설명됩니다. 세포 손상 수준을 평가하고 조직 재생의 자연적인 과정으로서 괴사를 프로그램 된 세포 사멸 (세포 사멸)과 구별하기위한 상세한 방법론이 설명됩니다. 옥살산과 살충제 (살충제 및 살비제)로 성인 꿀벌을 치료하고 심실 및 HPG에서 세포 사멸을 측정 한 결과가 제시됩니다. 방법론의 장단점도 논의됩니다.
Introduction
꿀벌 (Apis mellifera L.)은 다른 야생 수분 매개자 중에서도 농업 식물의 가장 중요한 수분 매개자입니다. 수천 년에 걸쳐 변화하는 환경은 꿀벌이 형태, 생리학, 행동 및 여러 병원체와 기생충에 대한 내성을 적응시키는 데 영향을 미쳤습니다. 따라서 꿀벌은 전 세계적으로 매우 다양한 종과 아종을 개발했습니다1. 이러한 결과는 꿀벌의 소화관 구조에 유전 적 변이가 있다는 이전 발견과 일치하지만 중추의 변화가 환경 요인 2,3에 기인 한 것임을 시사합니다.
꿀벌의 소화관에는 앞장, 중추 (심실) 및 뒷부4의 세 가지 주요 부분이 있습니다. 심실은 꽃가루와 꿀/꿀의 소화에 필수적인 기관입니다. 뒷다리에서 삼투압 조절은 물과 이온의 흡수를 통해 발생합니다2. 꿀벌 작업자의 하인두 땀샘 (HPG)은 머리에 위치하며 로열 젤리 성분을 합성하고 분비하여 무리, 여왕 및 식민지 구성원에게 먹이를줍니다. 그들의 크기는 나이와 작업에 따라 변하고 적절한 영양 (품질 꽃가루)에 달려 있습니다. 6 일에서 18 일 사이의 간호사는 양육을 수행하며 HPG의 크기는 5,6 증가합니다. 채집 꿀벌에서 HPG는 퇴화되어 꿀7에서 복잡한 당을 단순한 설탕 (α– 글루코시다 아제, 류신 아릴 아미다 제, 인버 타제)으로 전환하는 데 중요한 효소 만 분비합니다.
꿀벌은 여러 생물학적 및 비생물적스트레스 요인8에 노출되며 소화관은 여러 가지 부정적인 자극제의 영향을 받을 수 있습니다. 병원체로부터 유기체를 보호하는 첫 번째 장벽은 병원균으로부터 보호하기 위해 장 점막으로 구성된 중추의 주변 영양 막입니다4. HPG의 발달과 기능은 식단, 연령 및 집락 상태9에 따라 달라지며 살충제, 살비제10 및 병원균11,12,13의 영향을 받습니다. varroa 방제 처리 및 환경의 살충제로 인한 벌통의 살비제 잔류 물은 수렵 꿀벌과 간호사 꿀벌14,15에 영향을 미칩니다. 꿀벌 식민지에 대한 가장 큰 위협은 진드기 Varroa 소멸자로, 식민지 손실에 기여하는 바이러스 벡터16 및 숙주의 지방 신체 (꿀벌의 중요한 중요한 기관)의 소비자로서 결과적으로 개인의 신체와 식민지 기능에 영향을 미칩니다17.
그러나 집약적 인 농지 서식지는 꿀벌에게 단기적인 식량 공급을 제공 할 수 있습니다. 따라서 농업 환경 계획은 농업 경관에서 꿀 꽃의 가용성을 향상시켜야합니다18. 세포 또는 조직 수준, 특히 중추 및 HPG에서 다른 아종 6,19,20,21 또는 이러한 요인의 치명적인 영향을 평가하기 위해 조직 학적 및 면역 조직 화학적 방법은 꿀벌의 조직학 연구에 사용하기에 실용적이고 충분히 정확합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
살아있는 유기체에서, 세포 사멸은 아폽토시스 또는 괴사(25)로서 정의되고, 자가포식(autophagy)26을 동반할 수 있다. 세포 사멸과 괴사 세포의 차이점은 세포 사멸은 프로그램 된 세포 사멸의 한 형태이며 정상 세포에서 나타나는 반면 괴사는 치명적인 상태 (예 : 사고, 질병)로 인해 발생한다는 것입니다 27,28. 아폽토시?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
슬로베니아 연구 기관, 보조금 번호 P4-133의 지원에 감사드립니다.
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
Referências
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