Histologi grunder och celldödsdetektering i honungsbivävnad
Summary
Immunohistokemiska metoder är användbara i honungsbiforskning för att upptäcka och bedöma nivån av apoptos och nekros i midgut- och hypofaryngeala körtlar hos vuxna bin.
Abstract
Honungsbin (Apis mellifera L.) inuti bikupan (sjuksköterskor och andra bikupor) och utanför bikupan (födosökare) utsätts för klimat- och väderförändringar, olika bekämpningsmedel, patogener och undernäring, som huvudsakligen kommer in genom munnen och främst påverkar matsmältningsorganen hos vuxna bin. För att förstå och förhindra effekterna av sådana externa och interna stressfaktorer på honungsbin är en användbar forskningsmetod den immunohistokemiska metoden. Ett grundläggande protokoll beskrivs för att förbereda midgut (ventriculus) och hypofaryngeala körtlar (HPG) hos vuxna bin för histologisk analys. En detaljerad metod beskrivs för att bedöma nivån av cellskador och skilja nekros från programmerad celldöd (apoptos) som en naturlig process för vävnadsregenerering. Resultaten av vuxen honungsbibehandling med oxalsyra och bekämpningsmedel (insekticid och akaricid) och bestämning av celldöd i ventriculus och HPG presenteras. För- och nackdelar med metodiken diskuteras också.
Introduction
Honungsbin (Apis mellifera L.) är bland andra vilda pollinatörer de viktigaste pollinatörerna av jordbruksväxter. Under tusentals år har den förändrade miljön påverkat bin att anpassa sin morfologi, fysiologi, beteende och tolerans mot flera patogener och parasiter. Därför har honungsbin utvecklat ett mycket varierat utbud av arter och underarter runt om i världen1. Dessa resultat överensstämmer med tidigare fynd, att det finns genetisk variation i honungsbiets matsmältningsstruktur, men tyder också på att förändringar av midgut beror på miljöfaktorer 2,3.
Honungsbiets matsmältningsorgan har tre huvuddelar: foregut, midgut (ventriculus) och hindgut4. Ventriculus är ett viktigt organ för matsmältningen av pollen och nektar / honung; I bakguten sker osmotisk kontroll genom absorption av vatten och joner2. Hypofaryngeala körtlar (HPG) av honungsbiarbetare är belägna i huvudet och syntetiserar och utsöndrar kungliga gelékomponenter för att mata brödet, drottningen och medlemmarna i kolonin. Deras storlek förändras med ålder och uppgifter och beror på rätt näring (kvalitetspollen). Sjuksköterskor i åldern 6 till 18 dagar utför uppfödning av yngel och storleken på HPG ökar 5,6. I födosöksbin degenererar HPG: erna och utsöndrar endast enzymer som är viktiga för att omvandla de komplexa sockerarterna till enkla (α-glukosidaser, leucinarylamidas, invertas) i honung7.
Honungsbin utsätts för flera biotiska och abiotiska stressfaktorer8, och matsmältningskanalen kan påverkas av flera negativa stimulanser. Den första barriären som skyddar organismen från patogener är det peritrofa membranet i midguten, som består av tarmslimhinnan för att skydda mot patogener4. Utvecklingen och funktionen av HPG beror på kost, ålder och kolonitillstånd9 och påverkas av insekticider, akaricider 10 och patogener11,12,13. Akaricidrester i bikupan på grund av varroakontrollbehandling och bekämpningsmedel från miljön påverkar födosöksbin och sjuksköterska bin14,15. Det största hotet mot honungsbikolonier är kvalstret Varroa destructor, både som en vektor av virus som bidrar till koloniförluster16 och som konsument av värdens fettkropp (ett viktigt vitalt organ i honungsbin), vilket följaktligen påverkar individens kropp och kolonifunktioner17.
Intensiva livsmiljöer i odlingslandskapet kan dock ge honungsbin en kortsiktig livsmedelsförsörjning. Därför bör miljöprogram inom jordbruket öka tillgången på honungsblommor i jordbrukslandskap18. För att bedöma morfologin hos olika underarter 6,19,20,21 eller subletala effekter av dessa faktorer på cell- eller vävnadsnivåer, särskilt midgut och HPG, är histologiska och immunohistokemiska metoder praktiska och tillräckligt exakta för att kunna användas i histologiforskning i honungsbin.
Protocol
Representative Results
Discussion
I levande organismer definieras celldöd som apoptos eller nekros25 och kan åtföljas av autofagi26. Skillnaden mellan apoptotiska och nekrotiska celler är att apoptos är en form av programmerad celldöd och uppträder i normala celler, medan nekros uppstår på grund av dödliga tillstånd (t.ex. olycka, sjukdom)27,28. Apoptos kan detekteras med hjälp av analyssatser baserade på TUNEL-tekniken (detektion avDNA…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jag erkänner tacksamt stödet från den slovenska forskningsbyrån, bidrag nr P4-133.
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
Referências
- Ruttner, F. . Naturgeschichte der Honigbienen. , (1992).
- Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. . The Anatomy of the Honey Bee. , (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. . Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M. Honey bee toxicology. Annual Review of Entomology. 60 (1), 415-434 (2005).
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, &. #. 2. 1. 4. ;. Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. . Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D’Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
