Embryo-injectietechniek voor genbewerking in de zwartpootteek, Ixodes scapularis
Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode voor het injecteren van tekenembryo’s. Embryo-injectie is de voorkeurstechniek voor genetische manipulatie om transgene lijnen te genereren.
Abstract
Teken kunnen verschillende virale, bacteriële en protozoaire pathogenen overbrengen en worden daarom beschouwd als vectoren van medisch en veterinair belang. Ondanks de groeiende last van door teken overgedragen ziekten, is het onderzoek naar teken achtergebleven bij insectenziektevectoren als gevolg van uitdagingen bij het toepassen van genetische transformatietools voor functionele studies op de unieke biologie van teken. Genetische interventies hebben aandacht gekregen om door muggen overgedragen ziekten te verminderen. De ontwikkeling van dergelijke interventies vereist echter een stabiele kiembaantransformatie door embryo’s te injecteren. Een dergelijke embryo-injectietechniek ontbreekt voor cheliceraten, waaronder teken. Verschillende factoren, zoals een externe dikke waslaag op tekenembryo’s, hard chorion en hoge intra-ovale druk, zijn enkele obstakels die eerder de ontwikkeling van embryo-injectieprotocollen bij teken verhinderden. Het huidige werk heeft deze obstakels overwonnen en een embryo-injectietechniek voor de zwartbenige teek, Ixodes scapularis, wordt hier beschreven. Deze techniek kan worden gebruikt om componenten, zoals CRISPR/Cas9, te leveren voor stabiele kiembaantransformaties.
Introduction
Teken zijn vectoren van medisch en veterinair belang, die in staat zijn om een verscheidenheid aan virale, bacteriële, protozoaire pathogenen en nematoden over te brengen 1,2. In het oosten van de Verenigde Staten is de zwartpootteek Ixodes scapularis een belangrijke vector van de ziekte van Lyme (LD), de spirocheet Borrelia burgdorferi. Meer dan 400.000 gevallen van LD worden elk jaar gemeld in de Verenigde Staten, waardoor het de top vector-overgedragen infectieziekte in de VSis 1. Naast B. burgdorferi worden zes andere micro-organismen overgedragen door I. scapularis, waaronder vier bacteriën (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi pt Ehrlichia muris eauclarensis), één protozoaire parasiet (Babesia microti) en één virus (Powassan-virus), waardoor deze tekensoort een belangrijk probleem voor de volksgezondheid is3 . Hoewel door teken overgedragen ziekten de afgelopen jaren vaker voorkomen, is onderzoek naar teken achtergebleven bij andere geleedpotige vectoren, zoals muggen, vanwege de unieke biologie van teken en uitdagingen in verband met het toepassen van genetische en functionele genomische hulpmiddelen 4,5.
Genbewerkingstechnieken, met name CRISPR/Cas9, hebben nu functionele genomicastudies mogelijk gemaakt in niet-modelorganismen. Voor het creëren van erfelijke mutaties in een organisme blijft embryo-injectie de voorkeursmethode voor het leveren van constructies voor het veranderen van de kiembaan 6,7,8,9. Tot voor kortwerden tekeneieren echter als te moeilijk of zelfs onmogelijk beschouwd om te injecteren zonder het embryote doden 10,11. Een dikke waslaag op eieren, hard chorion en hoge intra-ovale druk waren enkele van de belangrijkste obstakels die embryo-injectie bij teken verhinderden. Volwassen, met bloed gevoede I. scapularis zetten een enkele koppeling van maximaal 2.000 eieren12 af gedurende 3-4 weken (ongeveer 100 eieren / dag). Eieren worden afzonderlijk gelegd en elk ei is bedekt met was die wordt afgescheiden door uitsteeksels of “hoorns” van het klierorgaan van Gené 13,14,15 van de moeder. Deze was beschermt de eieren tegen uitdroging en bevat antimicrobiële stoffen15. Om tekeneieren met succes te injecteren, is het belangrijk om de waslaag te verwijderen, het chorion te verzachten en de eieren uit te drogen om de intraovaldruk te verlagen, zodat de injectie het ei niet onomkeerbaar beschadigt. Inzicht in het kritieke belang van embryo-injecties voor succesvolle kiembaantransformatie, wordt een protocol voor I. scapularis ontwikkeld, dat kan worden gebruikt om een CRISPR / Cas9-construct af te leveren en stabiele kiembaanmutaties te genereren4. Naast de bijdrage aan het I. scapularis-onderzoek zou dit protocol ook geoptimaliseerd kunnen worden voor andere tekensoorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit is het eerste protocol dat is ontwikkeld om vroege tekenembryo’s met succes te injecteren. Een overlevingspercentage van ~ 4% -8% is bereikt, wat vergelijkbaar is met embryo-injectie in andere gevestigde insectenmodellen5.
Aangezien dit het initiële protocol is, wordt verwacht dat dit protocol verder zal worden verfijnd en gespecialiseerd voor individuele tekensoorten. In het bijzonder zal de injectietiming variëren van soort tot soort, afhankelijk van embryogenes…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen Channa Aluvihare en Yonus Gebermicale, ITF, UMD, voor inzicht en ondersteuning tijdens de beginfase van protocolontwikkeling. Wolfraamnaalden waren een gulle gift van David O’Brochta, ITF, UMD. We zijn Dr. Ladislav Simo dankbaar voor het testen van dit protocol in I. ricinus en voor inzichtelijke discussies. Dit project werd gefinancierd door NIH-NIAID R21AI128393 en Plymouth Hill Foundation, NY naar MG-N, startup-fondsen van de Universiteit van Nevada tot AN, de National Science Foundation Grant No. 2019609 tot MG-N en AN, en een Peer-to-Peer Grant van IGTRCN tot AS.
Materials
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
Referências
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
