Tecnica di iniezione di embrioni per l'editing genetico nella zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis
Summary
Il presente protocollo descrive un metodo per iniettare embrioni di zecca. L’iniezione di embrioni è la tecnica preferita per la manipolazione genetica per generare linee transgeniche.
Abstract
Le zecche possono trasmettere vari patogeni virali, batterici e protozoari e sono quindi considerate vettori di importanza medica e veterinaria. Nonostante il crescente onere delle malattie trasmesse dalle zecche, la ricerca sulle zecche è rimasta indietro rispetto ai vettori di malattie degli insetti a causa delle sfide nell’applicazione di strumenti di trasformazione genetica per studi funzionali alla biologia unica delle zecche. Gli interventi genetici hanno guadagnato attenzione per ridurre le malattie trasmesse dalle zanzare. Tuttavia, lo sviluppo di tali interventi richiede una trasformazione germinale stabile mediante iniezione di embrioni. Tale tecnica di iniezione di embrioni è carente per i chelicerati, comprese le zecche. Diversi fattori, come uno spesso strato di cera esterno sugli embrioni di zecche, corion duro e alta pressione intraovale, sono alcuni ostacoli che in precedenza impedivano lo sviluppo del protocollo di iniezione embrionale nelle zecche. Il presente lavoro ha superato questi ostacoli e qui è descritta una tecnica di iniezione di embrioni per la zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis. Questa tecnica può essere utilizzata per fornire componenti, come CRISPR / Cas9, per trasformazioni germinali stabili.
Introduction
Le zecche sono vettori di importanza medica e veterinaria, in grado di trasmettere una varietà di patogeni virali, batterici, protozoari e nematodi 1,2. Negli Stati Uniti orientali, la zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis, è un importante vettore del patogeno della malattia di Lyme (LD), la spirocheta Borrelia burgdorferi. Oltre 400.000 casi di LD sono segnalati ogni anno negli Stati Uniti, rendendola la principale malattia infettiva trasmessa da vettori negli Stati Uniti1. Oltre a B. burgdorferi, altri sei microrganismi sono trasmessi da I. scapularis, tra cui quattro batteri (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi e Ehrlichia muris eauclarensis), un protozoo parassita (Babesia microti) e un virus (Powassan virus), rendendo questa specie di zecche un importante problema di salute pubblica3 . Mentre le malattie trasmesse dalle zecche sono diventate più diffuse negli ultimi anni, la ricerca sulle zecche è rimasta indietro rispetto ad altri vettori di artropodi, come le zanzare, a causa della biologia unica delle zecche e delle sfide associate all’applicazione di strumenti genomici genetici e funzionali 4,5.
Le tecniche di modifica genetica, in particolare CRISPR / Cas9, hanno ora reso fattibili studi di genomica funzionale in organismi non modello. Per creare mutazioni ereditabili in un organismo, l’iniezione di embrioni rimane il metodo preferito per fornire costrutti per alterare la linea germinale 6,7,8,9. Tuttavia, fino a poco tempo fa4, le uova di zecca erano considerate troppo difficili o addirittura impossibili da iniettare senza uccidere l’embrione10,11. Uno spesso strato di cera sulle uova, corion duro e alta pressione intraovale erano alcuni dei principali ostacoli che impedivano l’iniezione di embrioni nelle zecche. Gli adulti, alimentati con sangue I. scapularis depositano una singola frizione fino a 2.000 uova12 in 3-4 settimane (circa 100 uova / giorno). Le uova vengono deposte singolarmente e ogni uovo è ricoperto di cera secreta da sporgenze o “corna” dell’organo ghiandolare di Gené13,14,15 della madre. Questa cera protegge le uova dall’essiccazione e contiene composti antimicrobici15. Per iniettare con successo le uova di zecca, è importante rimuovere lo strato di cera, ammorbidire il corion e asciugare le uova per ridurre la pressione intraovale in modo che l’iniezione non danneggi irreversibilmente l’uovo. Comprendendo l’importanza critica delle iniezioni embrionali per il successo della trasformazione germinale, viene sviluppato un protocollo per I. scapularis, che può essere utilizzato per fornire un costrutto CRISPR / Cas9 e generare mutazioni germinali stabili4. Oltre al suo contributo alla ricerca su I. scapularis, questo protocollo potrebbe anche essere ottimizzato per altre specie di zecche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo è il primo protocollo sviluppato per iniettare con successo embrioni di zecca precoci. È stato raggiunto un tasso di sopravvivenza di ~ 4% -8%, che è paragonabile all’iniezione di embrioni in altri modelli di insetti ben consolidati5.
Poiché questo è il protocollo iniziale, si prevede che questo protocollo sarà ulteriormente perfezionato e specializzato per le singole specie di zecche. In particolare, i tempi di iniezione varieranno da specie a specie, a se…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Channa Aluvihare e Yonus Gebermicale, ITF, UMD, per la comprensione e il supporto durante la fase iniziale dello sviluppo del protocollo. Gli aghi di tungsteno sono stati un dono generoso di David O’Brochta, ITF, UMD. Siamo grati al Dr. Ladislav Simo per aver testato questo protocollo in I. ricinus e per le discussioni approfondite. Questo progetto è stato finanziato da NIH-NIAID R21AI128393 e Plymouth Hill Foundation, NY a MG-N, fondi di avvio dall’Università del Nevada ad AN, il National Science Foundation Grant No. 2019609 a MG-N e AN e una sovvenzione peer-to-peer da IGTRCN a AS.
Materials
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
Referências
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