クロマダニの遺伝子編集のための胚注入技術
Summary
本プロトコルは、ダニ胚を注入するための方法を記載する。胚注入は、トランスジェニック株を生成するための遺伝子操作のための好ましい技術である。
Abstract
ダニは、さまざまなウイルス性、細菌性、および原生動物の病原体を感染させる可能性があるため、医学的および獣医学的に重要なベクターと見なされます。ダニ媒介性疾患の負担が増大しているにもかかわらず、機能研究のための遺伝子形質転換ツールをダニのユニークな生物学に適用する際の課題のために、ダニに関する研究は昆虫病媒介動物に遅れをとっています。蚊が媒介する病気を減らすために遺伝的介入が注目を集めています。しかしながら、そのような介入の開発は、胚を注入することによる安定した生殖系列形質転換を必要とする。そのような胚注入技術は、ダニを含むキリセレートには欠けている。ダニ胚の外部の厚いワックス層、硬い絨毛膜、高い楕円形内圧などのいくつかの要因は、以前はダニの胚注入プロトコルの発達を妨げていたいくつかの障害です。本研究ではこれらの障害を克服し、クロマダニ Ixodes scapularis の胚注入技術について述べる。この手法は、安定した生殖細胞系列形質転換のためのCRISPR/Cas9などの成分を送達するために使用できます。
Introduction
ダニは医学的および獣医学的に重要なベクターであり、さまざまなウイルス性、細菌性、原生動物病原体および線虫を感染させることができます1,2。米国東部では、黒脚ダニ、Ixodes scapularisは、ライム病(LD)病原体であるスピロヘータボレリアブルグドルフェリの重要なベクターです。米国では毎年40万人以上のLDが報告されており、米国で最大のベクター媒介感染症となっています1。B. burgdorferiに加えて、4つの細菌(アナプラズマ食サイトフィルム、B. mayonii、B. miyamotoi、およびEhrlichia muris eauclarensis)、1つの原虫寄生虫(Babesia microti)、および1つのウイルス(Powassanウイルス)を含む6つの他の微生物がI.肩甲骨によって伝染し、このダニ種を主要な公衆衛生上の懸念事項にしています3。.ダニ媒介性疾患は近年より蔓延していますが、ダニの研究は、ダニの独特の生物学と遺伝的および機能的ゲノムツールの適用に関連する課題のために、蚊などの他の節足動物ベクターに遅れをとっています4,5。
遺伝子編集技術、特にCRISPR/Cas9により、非モデル生物での機能ゲノミクス研究が可能になりました。生物において遺伝性突然変異を作り出すために、胚注入は、生殖系列6、7、8、9を改変するための構築物を送達するための好ましい方法であり続ける。しかし、最近まで4、ダニの卵は胚を殺さずに注射することは難しすぎるか不可能でさえあると考えられていました10,11。卵の厚いワックス層、硬い絨毛膜、および高い楕円形内圧は、ダニへの胚注入を妨げる主な障害のいくつかでした。成体の、血液を与えられたI. scapularisは、3〜4週間で最大2,000個の卵12個の単一のクラッチを堆積させます(約100個の卵/日)。卵は単独で産まれ、各卵は母親の腺ジェネの器官13,14,15の突起または「角」によって分泌されるワックスでコーティングされています。このワックスは卵を乾燥から保護し、抗菌化合物を含んでいます15。ダニの卵をうまく注入するには、ワックス層を取り除き、絨毛膜を柔らかくし、卵を乾燥させて卵内圧を下げて、注射が卵を不可逆的に損傷しないようにすることが重要です。生殖系列の形質転換を成功させるための胚注射の決定的な重要性を理解し、肩甲骨菌のプロトコルが開発され、CRISPR/Cas9コンストラクトを送達し、安定した生殖系列変異を生成するために使用できます4。I. scapularis研究への貢献に加えて、このプロトコルは他のダニ種にも最適化される可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
これは、初期のダニ胚をうまく注入するために開発された最初のプロトコルです。生存率は~4%-8%で、これは他の確立された昆虫モデルの胚注入に匹敵します5。
これは最初のプロトコルであるため、このプロトコルはさらに洗練され、個々のダニ種に特化することが期待されます。特に、注入のタイミングは、胚形成、特に細胞化のタイミングに応じて?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、プロトコル開発の初期段階における洞察と支援について、チャンナ・アルビヘアとヨヌス・ゲベルミカレ(ITF、UMD)を認めている。タングステン針は、ITF、UMDのデビッドオブロチタからの寛大な贈り物でした。I . ricinus でこのプロトコルをテストし、洞察に満ちた議論をしてくれたLadislav Simo博士に感謝します。このプロジェクトは、NIH-NIAID R21AI128393とニューヨーク州プリマスヒル財団からMG-N、ネバダ大学からANへのスタートアップ資金、MG-NとANへの国立科学財団助成金番号2019609、IGTRCNからASへのピアツーピア助成金によって資金提供されました。
Materials
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
Referências
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