Trasformazione indotta dal mediatore dei fosfolipidi in colture tridimensionali
Summary
Il presente protocollo descrive la messa a punto di colture 3D “on top “ di una linea cellulare epiteliale mammaria non trasformata, MCF10A, che è stata modificata per studiare la trasformazione indotta dal fattore attivante piastrinico (PAF). L’immunofluorescenza è stata utilizzata per valutare la trasformazione ed è discussa in dettaglio.
Abstract
Diversi modelli sono stati sviluppati per studiare il cancro, come modelli di roditori e linee cellulari stabilite. Informazioni preziose sulla carcinogenesi sono state fornite da studi che utilizzano questi modelli. Le linee cellulari hanno fornito una comprensione della deregolazione della segnalazione molecolare associata alla tumorigenesi mammaria, mentre i modelli di roditori sono ampiamente utilizzati per studiare le caratteristiche cellulari e molecolari del cancro al seno in vivo. La creazione di colture 3D di cellule epiteliali e cancerose del seno aiuta a colmare il divario tra modelli in vivo e in vitro imitando le condizioni in vivo in vitro. Questo modello può essere utilizzato per comprendere la deregolazione di eventi di segnalazione molecolare complessi e le caratteristiche cellulari durante la carcinogenesi mammaria. Qui, un sistema di coltura 3D viene modificato per studiare una trasformazione indotta dal mediatore fosfolipidico (Fattore di attivazione piastrinica, PAF). Gli immunomodulatori e altre molecole secrete svolgono un ruolo importante nell’inizio e nella progressione del tumore nel seno. Nel presente studio, le colture acinose 3D di cellule epiteliali mammarie sono esposte a caratteristiche di trasformazione PAF come perdita di polarità e caratteristiche cellulari alterate. Questo sistema di coltura 3D aiuterà a far luce sulle perturbazioni genetiche e / o epigenetiche indotte da varie entità di piccole molecole nel microambiente tumorale. Inoltre, questo sistema fornirà anche una piattaforma per l’identificazione di geni nuovi e noti che potrebbero essere coinvolti nel processo di trasformazione.
Introduction
Una miriade di modelli sono disponibili per studiare la progressione del cancro, ognuno dei quali è unico e rappresenta un sottotipo di questa complessa malattia. Ogni modello fornisce informazioni uniche e preziose sulla biologia del cancro e ha migliorato i mezzi per imitare la condizione reale della malattia. Le linee cellulari consolidate cresciute come monostrato hanno fornito preziose informazioni sui processi vitali in vitro, come proliferazione, invasività, migrazione e apoptosi1. Sebbene la coltura cellulare bidimensionale (2D) sia stata lo strumento tradizionale per studiare la risposta delle cellule di mammifero a diverse perturbazioni ambientali, l’estrapolazione di questi risultati per prevedere le risposte a livello tissutale non sembra sufficientemente convincente. La principale limitazione delle colture 2D è che il microambiente creato differisce in gran parte da quello del tessuto mammario stesso2. La coltura 2D manca dell’interazione delle cellule con la matrice extracellulare, che è vitale per la crescita di qualsiasi tessuto. Inoltre, le forze di trazione sperimentate dalla cellula in colture monostrato ostacolano la polarità di queste cellule, alterando così la segnalazione e il comportamento cellulare 3,4,5. I sistemi di coltura tridimensionali (3D) hanno aperto una nuova strada nel campo della ricerca sul cancro con la loro capacità di imitare le condizioni in vivo in vitro. Molti segnali microambientali cruciali che vengono persi nella coltura cellulare 2D potrebbero essere ristabiliti utilizzando colture 3D di matrice extracellulare ricca di laminina (lrECM)6.
Diversi studi hanno identificato l’importanza del microambiente tumorale nella carcinogenesi 7,8. I fattori associati all’infiammazione sono una parte importante del microambiente. Il fattore attivante piastrinico (PAF) è un mediatore fosfolipidico secreto da varie cellule immunitarie che media le risposte immunitarie multiple 9,10. Alti livelli di PAF sono secreti da diverse linee cellulari di cancro al seno e sono associati a una maggiore proliferazione11. Studi del nostro laboratorio hanno dimostrato che la presenza prolungata di PAF nelle colture acinose porta alla trasformazione delle cellule epiteliali mammarie12. PAF attiva il recettore PAF (PAFR), attivando l’asse di segnalazione PI3K/Akt13. PAFR è anche segnalato per essere associato a EMT, invasione e metastasi14.
Il presente protocollo dimostra un sistema modello per studiare la trasformazione indotta da PAF, utilizzando colture 3D di cellule epiteliali mammarie, come è stato precedentemente descritto da Chakravarty et al.12. Le cellule epiteliali mammarie cresciute sulla matrice extracellulare (colture 3D) tendono a formare sferoidi polarizzati arrestati dalla crescita. Questi sono chiamati acini e assomigliano molto agli acini del tessuto mammario, la più piccola unità funzionale della ghiandola mammaria, in vivo15. Questi sferoidi (Figura 1A,B) sono costituiti da un monostrato di cellule epiteliali polarizzate strettamente imballate che circondano un lume cavo e attaccate alla membrana basale (Figura 1C). Questo processo di morfogenesi è stato ben descritto in letteratura16. Quando seminano su lrECM, le cellule subiscono divisione e differenziazione per formare un gruppo di cellule, che poi si polarizzano dal giorno 4 in poi. Al giorno 8, gli acini sono costituiti da un gruppo di cellule polarizzate che sono in contatto diretto con la matrice extracellulare e un gruppo di cellule non polarizzate racchiuse all’interno delle cellule polarizzate esterne, senza contatto con la matrice. Queste cellule non polarizzate sono note per andare incontro ad apoptosi entro il giorno 12 della coltura, formando un lume cavo. Entro il giorno 16, le strutture in arresto della crescita si formano16.
Figura 1: Nuclei di cellule in acini colorati con una colorazione nucleare . (A) Costruzione 3D degli acini. (B) Immagine a contrasto di fase di MCF10A acini coltivati su Matrigel per 20 giorni. (C) La sezione più centrale mostra la presenza di un lume cavo. Barra di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
A differenza delle colture 2D, le colture di acinosi aiutano a distinguere le cellule normali e trasformate attraverso apparenti cambiamenti morfologici. Le cellule epiteliali mammarie non trasformate formano acini con un lume cavo, imitando i normali acini del seno umano. Questi sferoidi, dopo la trasformazione, mostrano una morfologia perturbata caratterizzata da una grave perdita di polarità (uno dei segni distintivi del cancro), assenza di un lume o rottura del lume cavo (a causa dell’evasione dell’apoptosi) che può essere indotta a causa della deregolazione di vari geni17,18,19,20 . Queste trasformazioni possono essere studiate utilizzando tecniche comunemente usate come l’immunofluorescenza. Pertanto, il modello di coltura cellulare 3D può funzionare come un metodo semplice per studiare il processo di morfogenesi acinogenesi del seno e la carcinogenesi del seno. Stabilire un sistema di coltura 3D per comprendere l’effetto di un mediatore dei fosfolipidi, PAF, aiuterà nello screening preclinico dei farmaci ad alto rendimento.
Questo lavoro ha adattato il protocollo di coltura 3D “on top”16,21 per studiare la trasformazione indotta da PAF 22. I cambiamenti fenotipici indotti dall’esposizione degli acini al mediatore fosfolipidico sono stati studiati utilizzando l’immunofluorescenza. Nello studio sono stati utilizzati vari marcatori di polarità ed epiteliale-transizione mesenchimale (EMT)12,16. La Tabella 1 menziona la loro normale localizzazione e il loro fenotipo atteso dopo la trasformazione.
| Anticorpi | Marchi | Localizzazione normale | Fenotipo trasformato |
| α6-integrina | Basolaterale | Basali con debole macchia laterale | Forte macchia laterale / apicale |
| β-catenina | Giunzione cellula-cellula | Basolaterale | Localizzazione anomala / nucleare o citoplasmatica |
| Vimentino | Emt | Presenza assente / debole | Up-regulation |
Tabella 1: Marcatori utilizzati nello studio. Diversi marcatori utilizzati con la loro localizzazione in presenza e assenza di trattamento PAF.
Questo metodo può essere utilizzato al meglio per studiare / selezionare farmaci plausibili e geni bersaglio per vari sottotipi di cancro al seno. Ciò può fornire dati di risposta ai farmaci più vicini allo scenario in vivo , contribuendo a uno sviluppo più rapido e affidabile del farmaco. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per studiare la segnalazione molecolare associata alla risposta ai farmaci e alla resistenza ai farmaci.
Protocol
Representative Results
Discussion
I modelli basati su linee cellulari consolidate sono ampiamente utilizzati per studiare il processo di cancerogenesi. Le colture monostrato di cellule continuano a fornire informazioni sulle varie vie di segnalazione molecolare che mediano i cambiamenti caratteristici nelle cellule tumorali32. Studi sul ruolo di oncogeni ben noti come Ras, Myc e p53 mutati sono stati riportati per la prima volta utilizzando colture monostrato come sistema modello33,34,35,36<sup c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l’IISER Pune Microscopy Facility per l’accesso alle attrezzature e alle infrastrutture e il supporto per gli esperimenti. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del Dipartimento di Biotecnologia (DBT), Govt. of India (BT / PR8699 / MED / 30/1018 / 2013), Science and Engineering Research Board (SERB), Govt. of India (EMR / 2016 / 001974) e in parte da IISER, finanziamento Pune Core. A. K. è stato finanziato dalla borsa di studio CSIR-SRF, L.A. è stato finanziato dalla borsa di studio DST-INSPIRE, V.C. è stato finanziato da DBT (BT / PR8699 / MED / 30/1018/2013).
Materials
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | AA433689M | |
| Anti Mouse Alexa Flour 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Anti Rabbit Alexa Flour 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Chamber Coverglass | Nunc | 155409 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL in dH2O |
| Confocal Microscope | Leica | Leica SP8 | |
| DMEM | Gibco | 11965126 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL in dH2O |
| F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| GM130 antibody | Abcam | ab52649 | |
| Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| Hoechst | Invitrogen | 33258 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL in ethanol |
| Image Processing Software | ImageJ | ||
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock dH2O |
| lrECM (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) | Invitrogen | S36937 | |
| Nuclear Stain (Hoechst) | Invitrogen | 33258 | |
| PAF | Cayman Chemicals | 91575-58-5 | Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Tris Base | Sigma | B9754 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| α6-integrin antibody | Millipore | MAB1378 |
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