Denne protokol beskriver zygote mikroinjektion af CRISPR-Cas9 og donor-DNA for effektivt at producere genkassetteknock-in og floxede mus.
CRISPR-Cas-teknologien har muliggjort hurtig og ubesværet generering af genetisk modificerede mus. Specifikt produceres mus og punktmutante mus let ved elektroporation af CRISPR-faktorer (og enkeltstrengede oligo-DNA-donorer) i zygoten. I modsætning hertil genereres genkassette (>1 kb) knock-in og floxede mus hovedsageligt ved mikroinjektion af CRISPR-faktorer og dobbeltstrengede DNA-donorer i zygoter. Genomredigeringsteknologier har også øget fleksibiliteten i produktionen af genetisk modificerede mus. Det er nu muligt at introducere de tilsigtede mutationer i målgenomområderne i en række gavnlige indavlede musestammer. Vores team har produceret over 200 genkassette knock-in muselinjer og over 110 floxed muselinjer ved zygote mikroinjektion af CRISPR-Cas9 efter anmodninger fra flere lande, herunder Japan. Nogle af disse genomredigeringer brugte BALB / c, C3H / HeJ og C57BL / 6N indavlede stammer, men mest brugte C57BL / 6J. I modsætning til elektroporationsmetoden er genomredigering ved zygotemikroinjektion i forskellige indavlede stammer af mus ikke så let. Genkassette knock-in og floxed mus på enkelt indavlede genetiske baggrunde er imidlertid lige så kritiske som genetisk humaniserede, fluorescerende reporter og betingede knockout-musemodeller. Derfor præsenterer denne artikel protokollen for zygotemikroinjektion af CRISPR-faktorer og dobbeltstrengede DNA-donorer i C57BL/6J-mus til generering af genkassetteknock-in og floxede mus. Denne artikel fokuserer udelukkende på nuklear injektion snarere end cytoplasmatisk injektion. Ud over zygote mikroinjektion skitserer vi tidslinjen for produktionsprocessen og perifere teknikker såsom induktion af superovulation og embryooverførsel.
Knock-in-mus, hvor de tilsigtede eksogene gener introduceres på målstedet, anvendes i vid udstrækning i mange in vivo-undersøgelser som genhumaniserede mus, fluorescerende reportermus og Cre-drivermus 1,2. Når knock-in-mutationer induceres ved genomredigering i musezygoter, anvendes enkeltstrenget DNA (enkeltstrengede oligo-DNA-donorer, ssODN) eller dobbeltstrenget DNA (dsDNA) som donor-DNA 2,3. ssODN bruges hovedsageligt til at banke relativt korte genfragmenter på mindre end 200 bp4 ind. Det er muligt at banke fragmenter længere end 1 kb DNA ved hjælp af lange ssODN’er (lsODN)5,6, men deres forberedelse er tidskrævende. Når dsDNA-donorer anvendes, kan genkassette (>1 kb) knock-in-mus genereres uden besværlig donor-DNA-forberedelse7.
Den største fordel ved at bruge ssODN’er er, at elektroporation8 kan generere knock-in mus. Imidlertid skal dsDNA-donorer indføres direkte i kernen ved zygote mikroinjektion. Samtidig knock-in på to steder er nødvendig for at skabe floxed mus, hvor hver loxP-sekvens bankes ind opstrøms og nedstrøms for målgenet. Der er to måder at generere floxede mus ved genomredigering i musezygoter – ved hjælp af to uafhængige ssODN’er, der hver bærer et enkelt loxP-sted eller bruger et enkelt dsDNA (eller lsDNA) med en floxed sekvens; Førstnævnte er meget ineffektiv 9,10,11. Genomredigering ved hjælp af dsDNA-donorer er den enkleste tilgang til at producere genkassetteknock-in og floxede mus, hvis miljøet er befordrende for zygotemikroinjektion.
Indledningsvis anvendes blandinger af Cas9 mRNA og sgRNA eller DNA-vektorer, der koder for sgRNA og Cas9, til genomredigering i musezygoter12,13. Da stabile Cas9-proteiner af høj kvalitet nu er tilgængelige til en lav pris, er introduktionen af crRNA-tracrRNA-Cas9 ribonukleoprotein (RNP) i musezygoter14 blevet populær. For nylig er knock-in-mus blevet genereret med høj effektivitet ved at indføre crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP og donor-DNA i begge pronuclei af musezygoter i en cellecyklusfase, hvor knock-in mest sandsynligt forekommer15. Derfor beskriver denne protokol teknikker til fremstilling af forskellige typer knock-in-mus ved denne metode.
Der er mange nyttige indavlede stammer af laboratoriemus16. Gensplejsning inden for den indavlede baggrund kan se bort fra den genetiske baggrunds indflydelse på fænotypen. Denne artikel beskriver en metode til at inducere genkassette knock-in og floxed mutationer i zygoten af den mest almindeligt anvendte indavlede muselinje, C57BL/6J17. Endvidere diskuteres tidsplanen for generering af genetisk modificerede mus og de anvendte perifere teknikker, herunder induktion af superovulation og embryooverførsel.
I denne undersøgelse blev friske (ikke frosne-optøede) C57BL/6J musezygoter, opnået ved naturlig parring, anvendt til genomredigering af museproduktion. Ved at injicere crRNA-tracrRNA-Cas9 og donor-DNA (RNPD) i begge pronuclei af disse zygoter i en cellecyklusfase, hvor knock-in er mest sandsynligt, blev genkassetteknock-in og floxed mus genereret med en høj fødselsrate og tilstrækkelig genomredigeringseffektivitet. Den aktuelle undersøgelse styrker udvidelsesmulighederne for SPRINT-CRISPR-metode15, hvor den sikrer tilstrækkelig knock-in-effektivitet selv i C57BL/6J-genetisk baggrund og kan anvendes til produktion af floxede mus.
Elektroporation er en meget generaliseret metode til fremstilling af genomredigerede mus på grund af de lave omkostninger ved de eksperimentelle enheder og den lette indlæring af teknikken8. Desuden kræver i-GONAD-metode19, hvor genomredigering udføres med præimplantationsembryoner, der findes i ovidukten, ikke en modtagermus. Sammenlignet med disse metoder er den nuværende metode, der præsenteres her, dyr og tidskrævende, når man forbereder og vedligeholder et eksperimentelt miljø med hensyn til både hardware og software. Men når forsøgsfaciliteterne er oprettet, kan komplekse genkassetteknock-in og floxede mus produceres med kun kommercielt tilgængelige CRISPR-elementer (crRNA, tracrRNA og Cas9-protein) og en simpel, lille mængde cirkulær plasmidvektor, der skal bruges som donor-DNA. Det betyder, at mange komplekse genomredigerede muselinjer kan produceres uden behov for tidskrævende (eller relativt dyre) lsODN 5,6 eller adeno-associerede virusvektorer20 at forberede.
I modsætning til den oprindelige SPRINT-CRISPR-metode15 blev der anvendt friske (frosne-optøede) zygoter. Ved opnåelse af friske zygoter ved naturlig parring kan de tekniske fejl ignoreres, der kan opstå under in vitro-befrugtning eller frysning og optøning. Desuden kan embryomanipulationsprocessen afsluttes på ca. en halv dag (figur 1) efter den nuværende fremgangsmåde. På den anden side inkluderer nogle begrænsninger ved den nuværende metode kravet om mange hanmus, den løse kontrol af befrugtningstimen og den begrænsede evne til fuldstændigt at forudsige antallet af zygoter til mikroinjektion. Sammenlignet med den oprindelige SPRINT-CRISPR-metode kan denne metode have en højere fødselsrate (tabel 1). På trods af dette kan det ikke konkluderes, at den nuværende metode er bedre med hensyn til fødselsrate på grund af forskellene i eksperimentledere, målgener, genetisk baggrund og timing af embryobekræftelse.
Som vist i tabel 1 havde et stort antal mus i de fleste genkassetteknock-in-projekter tilfældige integrationsalleler. Tilfældig integration skal elimineres, fordi det kan føre til utilsigtet forstyrrelse af endogene gener og ektopisk ekspression af transgener. Udfordringen for fremtiden er at finde eksperimentelle forhold, der reducerer antallet af tilfældige integrationshændelser, samtidig med at der opretholdes tilstrækkelig knock-in-effektivitet.
Næsten al musezygote-genomredigering ved hjælp af genomredigeringseffektorer, der resulterer i DNA-dobbeltstrengsbrud, vil sandsynligvis fremkalde utilsigtede mutationer på målsteder 9,21. Resultaterne af disse utilsigtede mutationer på målet er ikke beskrevet her, fordi vi ikke er i en situation, hvor den næste generation af mus kan styres for at præsentere klare beviser for dem. Den bedste måde at udelukke bekymringen for forvirring forårsaget af utilsigtet mutagenese på målet er at få den næste generation af mus ved at parre grundlæggere med vildtypemus snarere end krydsende grundlæggere. I princippet er N1-musene som følge af dette kryds vildtype (WT) på den ene side af allelen, så hvis den tilsigtede knock-in (KI) allel detekteres, er de WT/KI heterozygote. Derfor er mutagenesen på målet ikke et kritisk problem i laboratoriemusen, som har en relativt hurtig livscyklus og er et produktivt dyr. Der vil imidlertid være behov for yderligere forbedringer, når denne teknologi anvendes på relativt store pattedyr.
Det er blevet bekræftet, at denne teknologi kan producere genkassettebankmus i andre indavlede stammer end C57BL/6J, men et tilstrækkeligt antal projekter er ikke sikret, og dataene varierer meget. Derfor er disse oplysninger ikke medtaget i nærværende undersøgelse. Det menes, at yderligere undersøgelser om dette emne vil være nødvendige for at fremme musegenetik og sygdomsmodelforskning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af videnskabelig forskning (B) (19H03142: til SM), videnskabelig forskning (A) (20H00444: til FS), videnskabelig forskning (A) (21H04838: til SM) og videnskabelig forskning på innovative områder “Platform of Advanced Animal Model Support” (16H06276: til ST) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi. Bidragyderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om udgivelse eller manuskriptforberedelse. Vi er Ryoichi Mori taknemmelige for hans nyttige diskussion om genomredigeringsdesign.
Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | – | |
Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
Butorphanol | Meiji Seika Pharma | – | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old |
Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
crRNA | IDT | – | |
Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
hCG | ASKA Animal Health | – | |
Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
ICR mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
Inverted microscope | Leica | ||
KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
Medetomidine | ZENOAQ | – | |
Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
Micromanipulator units | Narishige | ||
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | – | |
MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
PMSG | ASKA Animal Health | – | |
Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
RNase | QIAGEN | 19101 | |
RNase Free Water | IDT | – | tracrRNA Accessory Reagents |
Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
tracrRNA | IDT | – |