Det nuvarande protokollet beskriver zygotmikroinjektion av CRISPR-Cas9 och donator-DNA för att effektivt producera genkassettknock-in och floxed möss.
CRISPR-Cas-tekniken har möjliggjort snabb och enkel generering av genetiskt modifierade möss. Specifikt produceras möss och punktmutanta möss lätt genom elektroporering av CRISPR-faktorer (och enkelsträngade oligo-DNA-donatorer) i zygoten. Däremot genereras genkassett (>1 kb) knock-in och floxade möss huvudsakligen genom mikroinjektion av CRISPR-faktorer och dubbelsträngade DNA-donatorer i zygoter. Genomredigeringsteknik har också ökat flexibiliteten hos genetiskt modifierad mössproduktion. Det är nu möjligt att introducera de avsedda mutationerna i de genomiska målregionerna i ett antal fördelaktiga inavlade musstammar. Vårt team har producerat över 200 genkassetter knock-in muslinjer och över 110 floxed muslinjer genom zygotmikroinjektion av CRISPR-Cas9 efter förfrågningar från flera länder, inklusive Japan. Några av dessa genomredigeringar använde BALB / c, C3H / HeJ och C57BL / 6N inavlade stammar, men de flesta använde C57BL / 6J. Till skillnad från elektroporeringsmetoden är genomredigering genom zygotmikroinjektion i olika inavlade stammar av möss inte så lätt. Genkassettknock-in och floxade möss på enstaka inavlade genetiska bakgrunder är dock lika kritiska som genetiska humaniserade, fluorescerande reporter och villkorliga knockoutmusmodeller. Därför presenterar denna artikel protokollet för zygotmikroinjektion av CRISPR-faktorer och dubbelsträngade DNA-donatorer i C57BL / 6J-möss för att generera genkassettknock-in och floxed möss. Denna artikel fokuserar uteslutande på kärninjektion snarare än cytoplasmatisk injektion. Förutom zygotmikroinjektion beskriver vi tidslinjen för produktionsprocessen och perifera tekniker såsom induktion av superovulation och embryoöverföring.
Knock-in-möss, där de avsedda exogena generna introduceras vid målplatsen, används ofta i många in vivo-studier som genhumaniserade möss, fluorescerande reportermöss och Cre-drivmöss 1,2. När knock-in-mutationer induceras genom genomredigering i muszygoter används enkelsträngat DNA (enkelsträngade oligo-DNA-donatorer, ssODN) eller dubbelsträngat DNA (dsDNA) som donator-DNA 2,3. ssODN används främst för att slå in relativt korta genfragment på mindre än 200 bp4. Det är möjligt att knacka in fragment längre än 1 kb DNA med långa ssODN (lsODN)5,6, men deras förberedelse är tidskrävande. När dsDNA-donatorer används kan genkassettmöss (>1 kb) genereras utan mödosam donator-DNA-beredning7.
Den främsta fördelen med att använda ssODN är att elektroporering8 kan generera knock-in möss. DSDNA-donatorer måste dock införas direkt i kärnan genom zygotmikroinjektion. Samtidig knock-in på två platser krävs för att skapa floxed möss, där varje loxP-sekvens slås in uppströms och nedströms målgenen. Det finns två sätt att generera floxade möss genom genomredigering i muszygoter – med hjälp av två oberoende ssODN, var och en med en enda loxP-plats, eller med en enda dsDNA (eller lsDNA) med en floxed sekvens; Den förra är mycket ineffektiv 9,10,11. Genomredigering med dsDNA-donatorer är det enklaste sättet att producera genkassettknock-in och floxade möss om miljön bidrar till zygotmikroinjektion.
Initialt används blandningar av Cas9 mRNA och sgRNA eller DNA-vektorer som kodar för sgRNA och Cas9 för genomredigering i muszygoter12,13. Eftersom högkvalitativa och stabila Cas9-proteiner nu finns tillgängliga till en låg kostnad har införandet av crRNA-tracrRNA-Cas9-ribonukleoprotein (RNP) i muszygoter14 blivit populärt. Nyligen har knock-in-möss genererats med hög effektivitet genom att införa crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP och donator-DNA i båda pronuclei av muszygoter i en cellcykelfas där knock-in sannolikt kommer att inträffa15. Därför beskriver detta protokoll tekniker för att producera olika typer av knock-in-möss med denna metod.
Det finns många användbara inavlade stammar av laboratoriemöss16. Genetisk modifiering inom den inavlade bakgrunden kan bortse från den genetiska bakgrundens påverkan på fenotypen. Denna artikel beskriver en metod för att inducera genkassettknock-in och floxed mutationer i zygoten av den vanligaste inavlade muslinjen, C57BL / 6J17. Vidare diskuteras tidslinjen för generering av genetiskt modifierade möss och de perifera tekniker som används, inklusive induktion av superovulation och embryoöverföring.
I den aktuella studien användes färska (inte frysta) C57BL / 6J-muszygoter, erhållna från naturlig parning, för genomredigering av musproduktion. Genom att injicera crRNA-tracrRNA-Cas9 och donator-DNA (RNPD) i båda pronuclei av dessa zygoter i en cellcykelfas där knock-in är mest sannolikt att inträffa, genererades genkassettknock-in och floxed möss med hög födelsetal och tillräcklig genomredigeringseffektivitet. Den aktuella studien stärker utbyggbarheten av SPRINT-CRISPR-metod15, där den säkerställer tillräcklig knock-in-effektivitet även i C57BL/6J genetisk bakgrund, och kan tillämpas på produktion av floxade möss.
Elektroporering är en mycket generaliserad metod för att producera genomredigerade möss på grund av den låga kostnaden för experimentella enheter och lättheten att lära sig tekniken8. Dessutom kräver i-GONAD-metoden19, där genomredigering görs med preimplantatoriska embryon som finns i äggledaren, inte en mottagarmus. Jämfört med dessa metoder är den nuvarande metoden som presenteras här kostsam och tidskrävande när man förbereder och underhåller en experimentell miljö när det gäller både hårdvara och mjukvara. Men när experimentanläggningarna är inrättade kan komplexa genkassettknock-in och floxade möss produceras med endast kommersiellt tillgängliga CRISPR-element (crRNA, tracrRNA och Cas9-protein) och en enkel, liten mängd cirkulär plasmidvektor som ska användas som donator-DNA. Detta innebär att många komplexa genomredigerade muslinjer kan produceras utan att tidskrävande (eller relativt dyra) lsODN 5,6 eller adenoassocierade virusvektorer20 behöver prepareras.
Till skillnad från den ursprungliga SPRINT-CRISPR-metoden15 användes färska (frysta) zygoter. När man får färska zygoter genom naturlig parning kan de tekniska fel ignoreras som kan uppstå under in vitro-befruktning eller frysning och upptining. Dessutom kan embryomanipuleringsprocessen slutföras på ungefär en halv dag (figur 1) enligt det nuvarande tillvägagångssättet. Å andra sidan inkluderar vissa begränsningar av den nuvarande metoden kravet på många hanmöss, den lösa kontrollen av befruktningstidpunkten och den begränsade förmågan att helt förutsäga antalet zygoter för mikroinjektion. Jämfört med den ursprungliga SPRINT-CRISPR-metoden kan denna metod ha högre födelsetal (tabell 1). Trots detta kan man inte dra slutsatsen att den nuvarande metoden är bättre när det gäller födelsetal på grund av skillnaderna i experimentledare, målgener, genetisk bakgrund och tidpunkt för embryobekräftelse.
Som visas i tabell 1 hade ett stort antal möss i de flesta genkassettknock-in-projekten slumpmässiga integrationsalleler. Slumpmässig integration måste elimineras eftersom det kan leda till oavsiktlig störning av endogena gener och ektopiskt uttryck av transgener. Utmaningen för framtiden är att hitta experimentella förhållanden som minskar antalet slumpmässiga integrationshändelser samtidigt som tillräcklig knock-in-effektivitet bibehålls.
Nästan all muszygotgenomredigering med genomredigeringseffektorer som resulterar i DNA-dubbelsträngbrott kommer sannolikt att inducera oavsiktliga mutationer på målplatserna 9,21. Resultaten av dessa oavsiktliga on-target-mutationer beskrivs inte här eftersom vi inte befinner oss i en situation där nästa generation möss kan hanteras för att presentera tydliga bevis på dem. Det bästa sättet att utesluta oron för förvirring orsakad av oavsiktlig mutagenes på målet är att få nästa generation möss genom att para grundare med vildtypsmöss snarare än korsande grundare. I princip är N1-mössen som härrör från detta kors vildtyp (WT) på ena sidan av allelen, så om den avsedda knock-in (KI) allelen detekteras är de WT / KI heterozygota. Därför är mutagenesen på målet inte ett kritiskt problem i laboratoriemusen, som har en relativt snabb livscykel och är ett produktivt djur. Ytterligare förbättringar kommer dock att bli nödvändiga när denna teknik tillämpas på relativt stora däggdjur.
Det har bekräftats att denna teknik kan producera genkassettknock-in-möss i andra inavlade stammar än C57BL/6J, men ett tillräckligt antal projekt är inte säkrade och data är mycket varierande. Av denna anledning ingår inte denna information i den aktuella studien. Man tror att ytterligare studier om detta ämne kommer att behövas för att främja musgenetik och sjukdomsmodellforskning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av vetenskaplig forskning (B) (19H03142: till SM), vetenskaplig forskning (A) (20H00444: till FS), vetenskaplig forskning (A) (21H04838: till SM) och vetenskaplig forskning om innovativa områden “Platform of Advanced Animal Model Support” (16H06276: till ST) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om publicering eller manuskriptberedning. Vi är tacksamma mot Ryoichi Mori för hans hjälpsamma diskussion om genomredigeringsdesign.
Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | – | |
Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
Butorphanol | Meiji Seika Pharma | – | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old |
Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
crRNA | IDT | – | |
Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
hCG | ASKA Animal Health | – | |
Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
ICR mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
Inverted microscope | Leica | ||
KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
Medetomidine | ZENOAQ | – | |
Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
Micromanipulator units | Narishige | ||
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | – | |
MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
PMSG | ASKA Animal Health | – | |
Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
RNase | QIAGEN | 19101 | |
RNase Free Water | IDT | – | tracrRNA Accessory Reagents |
Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
tracrRNA | IDT | – |