Som svar på den alvorlige akutte respiratoriske syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) -pandemien ble det utviklet en laboratorieprotokoll for å teste viral desinfeksjonseffekt av hvitvasking av tøymunnbind, bomullskrubber og dongeribukser. Phi6-viruset (bakteriofag) ble brukt som organisme for å teste desinfeksjonseffekt.
Denne protokollen gir et eksempel på en laboratorieprosess for å gjennomføre hvitvaskingsstudier som genererer data om virusdesinfeksjon. Mens protokollen ble utviklet for forskning under koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) pandemi, er den ment å være et rammeverk som kan tilpasses andre virusdesinfeksjonsstudier; Det demonstrerer trinnene for å forberede testviruset, inokulere testmaterialet, vurdere visuelle og integritetsendringer i de vasket elementene på grunn av hvitvaskingsprosessen, og kvantifisere reduksjonen i virusbelastning. I tillegg skisserer protokollen de nødvendige kvalitetskontrollprøvene for å sikre at eksperimentene ikke er partiske av forurensning og målinger / observasjoner som skal registreres for å spore materialintegriteten til personlig verneutstyr (PPE) -elementer etter flere hvitvaskingssykluser. De representative resultatene som presenteres med protokollen, bruker Phi6-bakteriofagen inokulert på bomullsskrubb, denim og bomullsdekkende materialer og indikerer at varmtvannsvaskings- og tørkeprosessen oppnådd over en 3-log (99,9%) reduksjon i virusbelastning for alle prøver (en 3-loggreduksjon er desinfeksjonsmiddelytelsesmetrisk i US Environmental Protection Agency’s Product Performance Test Guideline 810.2200). Reduksjonen i virusmengden var jevn på tvers av forskjellige steder på PPE-elementene. Resultatene av denne virusdesinfeksjonseffektivitetstestingsprotokollen skal hjelpe det vitenskapelige samfunnet til å undersøke effektiviteten av hjemmevasking for andre typer testvirus og hvitvaskingsprosedyrer.
Koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) -pandemien forårsaket enestående global forsyningskjedeforstyrrelse og førte til en kritisk mangel på mange varer, inkludert viktig personlig verneutstyr (PPE)1,2,3. De i høyrisikoyrker måtte tilpasse seg ved hjelp av anbefalte krisekapasitetsstrategier, og publikum vedtok bruk av ikke-spesialiserte gjenstander som ansiktsbelegg av tøymateriale primært for kildekontroll, men også for å gi noe åndedrettsvern for brukerne. I USA var spesialisert åndedrettsvern (dvs. filtrering av åndedrettsvern (FFR) som N95s) reservert for noen av disse høyrisikoyrkene (f.eks. Helsevesen) under forsyningsmangel4. Da man visste lite om overføring av alvorlig akutt luftveissyndrom coronavirus 2 (SARS-Cov-2), ble også en rekke andre typer klesmaterialer vurdert som barrierebeskyttelse tidlig i pandemien5. Med mangfoldet av stoffer som brukes til brukerbeskyttelse, oppstod spørsmål om bruk, gjenbruk og desinfeksjon / dekontaminering av disse elementene. Mens det i USA var allment akseptert at rutinemessig hvitvasking av ansiktsbelegg og andre klesplagg i hjemmet gjorde virus på disse overflatene ikke-smittsomme, eksisterte det lite data for å validere denne påstanden, og det manglet publiserte laboratorieprotokoller for testing. Formålet med forskningsprotokollen som presenteres her er å gi et eksempel på en laboratorieprosess for gjennomføring av hvitvaskingsstudier som genererer data om virusdesinfeksjon. Mens protokollen ble utviklet for forskning under COVID-19-pandemien, er den ment å være et rammeverk som kan tilpasses andre virusdesinfeksjonsstudier.
Klærnes rolle i sykdomsoverføring er et vanskelig konsept å kvantifisere. International Scientific Forum on Home Hygiene forsøkte denne utfordrende oppgaven ved å gjennomføre en gjennomgang av klærnes rolle i spredningen av smittsomme sykdommer kombinert med en risikovurdering av hjemmehygienepraksis6. Inkludert i dette arbeidet var gjennomgangen av flere vitenskapelige studier som undersøkte overlevelsen av forskjellige virusstammer på forskjellige typer stoffer som ull og bomull 7,8,9,10,11. Hver studie fokuserte på en annen type virus, inkludert vaccinia, poliovirus, respiratorisk syncytialt virus, herpesvirus og influensavirus. Overlevelsestidene for de forskjellige virusene på stoffene varierte fra 30 min til 5 måneder, avhengig av virus-materialkombinasjonen. Flere av studiene viste også overføring av viruskontaminering fra materialet til hendene. Som en del av publikasjonen ble effektiv hvitvasking diskutert som en viktig styringsteknikk for å redusere overføring, men anerkjente at størrelsen på virkningen av hvitvasking på å redusere sykdomsbyrden var avhengig av den spesifikke virusforurensningen og vanskelig å kvantifisere 7,8,9,10,11.
Hvitvaskingsprosessen ødelegger mikroorganismer ved hjelp av kjemiske, fysiske og termiske behandlingsprosesser. For eksempel kan såper og vaskemidler skille jord og kan gi noen kjemisk mediert antimikrobiell virkning. Fysisk kan fortynning og agitasjon hjelpe til med å redusere virusbelastningen. En studie som undersøkte utholdenheten til humant koronavirus HCoV-OC43 på bomullsprøver ved bruk av industrielle og innenlandske vaskesykluser med og uten temperatur og vaskemiddel, fant ikke noe påviselig virus ved vasking i uoppvarmet vann uten vaskemiddel, men at i nærvær av jordbelastning (kunstig spytt) krevde husholdningsvaskesykluser vaskemiddel for prøver å ha ikke-detekterte virusbelastninger12. Varmt vann i seg selv kan også gi et effektivt middel til å ødelegge noen mikroorganismer13,14.
I en nylig publikasjon som oppsummerer tilstanden til dagens vaskeripraksis, ble mange faktorer som stoffsammensetning, lagringsforhold, smussbelastning, vasketemperatur og tid og tørketemperatur identifisert som varierende i global hvitvaskingspraksis15. Mens hvitvasking er en vanlig rengjøringsmetode for en stor andel av befolkningen, gjør denne store variasjonen i eksisterende praksis å utstede detaljert veiledning for hvordan du gjør dette trygt og effektivt, når en vare kan være forurenset av et virus, utfordrende og sparsom. Under COVID-19-pandemien utstedte USAs sentre for sykdomskontroll og forebygging (CDC) veiledning om hvordan man vasker varer for huseiere16,17. Mye av denne hvitvaskingsveiledningen var basert på flere eldre studier om bakteriell desinfeksjon18,19 og støttet av flere benkestudier som har funnet innkapslede virus inaktivert i vann med vaskemidler20,21. Veiledningen kan oppsummeres som 1) følg produsentens instruksjoner for vaskemiddelet, 2) bruk den varmeste passende vanninnstillingen, og 3) tørk gjenstander helt. Begrunnelsen for disse anbefalingene var at vasking på varmest mulig syklus med vaskemiddel kombinert med fullstendig tørking (med varme om mulig) vil drepe SARS-CoV-2-viruset.
Det store antallet mulige variasjoner i hvitvaskingsprosessen nødvendiggjør en enhetlig protokoll, som presentert her, for å kunne isolere variabler og teste virusdesinfeksjonseffekten av spesifikke prosesser. Hensikten med denne protokollen kombinert med en instruksjonsvideo er å demonstrere en laboratoriebasert hvitvaskingsprosess for resirkulering i andre forskningsstudier. I tillegg bør resultatene av denne virusdesinfeksjonseffekttestingen bygge forbrukernes tillit til effektiviteten av hjemmevasking under virusbaserte pandemier.
Denne protokollen ble utviklet for å utføre systematisk laboratorietesting for å vurdere hvitvaskingseffektiviteten av virusdesinfeksjon fra PPE/klesplagg i full størrelse. Prosedyrene skisserer de kritiske trinnene for å forberede viruset, inokulere testmaterialet, vurdere endringene i elementene på grunn av hvitvaskingsprosessen og kvantifisere reduksjonen i virusbelastning som følge av hvitvasking (maskinvask og tørking) -prosessen. I tillegg skisserer protokollen de nødvendige kvalitetskontrollprøvene for å sikre at eksperimentene ikke er partiske av forurensning og målinger / observasjoner som skal registreres for å spore materialintegriteten til PPE-elementene etter flere hvitvaskingssykluser. Resultatene ved bruk av Phi6 indikerer at varmtvannsvaskingsprosessen som ble brukt i denne protokollen oppnådde en større enn 3-log reduksjon i virusbelastning for alle prøver (ansiktsdekning, skrubber og denimbukser). Virusbelastningsreduksjonen var også jevn på forskjellige steder på PPE / klesplaggene. For å demonstrere 3-log reduksjon krever denne protokollen bruk av høy virusbelastning og et stabiliseringsmiddel (biffekstrakt) som kanskje ikke er representativt for jordbelastningen for alle situasjoner.
Minivaskere og kompakte tørketromler ble valgt for å optimalisere antall replikeringseksperimenter som kunne utføres i en plassbegrenset setting og for å holde sterilisering av utstyr og vannvolum som ble brukt under forsøkene håndterbare for laboratoriepersonalet. Som et resultat av bruk av minivaskemaskinen ble skylletrinnene manuelle sammenlignet med de fleste applikasjoner for hvitvasking av hjemmet som er helautomatiserte. Det er også viktig å huske at maskinvask dominerer i utviklede land, men håndvask praktiseres fortsatt over hele verden15. I tillegg kan det hende at noen ikke har tilgang til varmt vann for vask, og andre lufttørker klær manuelt i stedet for maskintørking. Disse forskjellene i hvitvaskingspraksis ble ikke adressert i denne nåværende protokollen, men kan lett undersøkes med mindre modifikasjoner som å erstatte vaske- og tørketrinnene med å bruke en bøtte og en nær linje
Det har vært minimalt fokus på rengjøring/desinfisering av virusforurensede munnbind og gateklær i den vitenskapelige litteraturen i full skala. Mer vanlig er det at studier vurderer filtreringsytelsen til munnbind etter gjentatt vask og tørking, men evaluerer ikke effekten av virusdesinfeksjon27,28. For eksempel evaluerte Clapp og medarbeidere montert filtreringseffektivitet av tøymasker og modifiserte prosedyremasker og fant stor variasjon i ytelse, med enkle modifikasjoner som gir økt passform og filtreringseffektivitet29. En annen studie så på filtreringseffektiviteten til fire klutmasker av forskjellige materialer30, igjen med fokus på kildekontroll eller personlig beskyttelse. Dette kan skyldes manglende spesialisering for både den mikrobielle delen og mekanisk testing i samme laboratorium. Protokollen som presenteres her gir en evaluering av desinfeksjonseffekt samt vesentlig nedbrytning.
Det har vært en rekke dekontaminerings-/desinfeksjonsmetoder for engangs åndedrettsvern (primært N95s) som nylig er publisert i den vitenskapelige litteraturen31,32,33. Hovedfokuset på FFR (f.eks. N95s) skyldes den kritiske åndedrettsbeskyttelsen de gir for helsepersonell og andre frontlinjeyrker. Primære teknologier for respirasjonsdekontaminering involverte fordampet hydrogenperoksid (VHP), ultrafiolett bakteriedrepende stråling (UVGI) og fuktig varme (damp) for virusinaktivering. Viscusi og medarbeidere evaluerte fem dekontamineringsmetoder for FFR og UVGI; etylenoksid og VHP ble funnet å være de mest lovende dekontamineringsmetodene31. Fischer og medarbeidere evaluerte fire forskjellige dekontamineringsmetoder – UV-lys, tørr varme, 70% etanol og VHP – for deres evne til å redusere forurensning med SARS-CoV-2 og deres effekt på N95 respiratorfunksjon32. Det er mange tilleggsstudier om effektive dekontamineringsteknologier for FFR som ble oppsummert og publisert i 202033. Imidlertid er disse spesialiserte metodene ikke tilgjengelige eller designet for å brukes trygt av den gjennomsnittlige hjemme- eller småbedriftseieren.
Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av Phi6, en innhyllet bakteriofag som ligner på SARS-CoV-2, har piggproteiner, og er av tilsvarende størrelse (80-100 nm)34, for all testing. Siden Phi6 ikke er et kjent patogen, kan det manipuleres i et generelt mikrobiologisk biosikkerhetsnivå 1 (BSL-1) laboratorium. Effekt mot Phi6 kan indikere effekten av andre innkapslede virus, men empirisk verifisering for hvert virus av interesse er nødvendig35. Ved å bruke et lignende, ikke-patogent virusmiddel, er det håpet at denne protokollen kan gjentas andre steder og brukes til å studere fremtidige virusepidemier / pandemier. Fremtidig forskning kan omfatte bruk av desinfeksjonsmidler (f.eks. Blekemiddel) i tillegg til vaskemidler og en standardisert protokoll for håndvask og snortørking.
The authors have nothing to disclose.
Det amerikanske miljøvernbyrået (EPA) gjennom sitt kontor for forskning og utvikling ledet forskningen beskrevet her under EP-C-15-008 med Jacobs Technology Inc. Den er gjennomgått av byrået, men gjenspeiler ikke nødvendigvis byråets synspunkter. Ingen offisiell påtegning bør utledes. EPA støtter ikke kjøp eller salg av kommersielle produkter eller tjenester. Forfatterne vil gjerne takke EPA-entreprenører Denise Aslett for tilsynet med EPA RTP-mikrobiologi, Brian Ford, Rachael Baartmans og Lesley Mendez Sandoval for deres arbeid med dette prosjektet i EPA RTP mikrobiologilaboratoriet, Ramona Sherman for å gi EPA-kvalitetssikringsgjennomgangen, og Worth Calfee og Shannon Serre for å gi EPA tekniske vurderinger.
Freezer (- 80 °C) | ThermoFisher Scientific | FDE30086FA | |
Hot Plate | VWR | 97042-714 | |
Safety Pins (steel) | Singer | 319921 | |
Shaker | Lab-Line Instruments, Inc. | 3525 | |
SM buffer | Teknova, Hollister, CA | S0249 | |
Syringe filter (0.2 μm) | Corning, Corning, NY | PES syringe filters, 431229 | |
1X Phosphate Buffered Saline | Teknova, Hollister, CA | P0196, 10X PBS solution | |
Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
Autoclavable caps | DWK Life Sciences, Millville, NJ | KIM-KAP Caps, 73663-18 | |
Autoclave | Steris | AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS | |
Beef Extract | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA | P/N B4888-100g | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 793639 | |
Cell spreaders | Busse Hospital Disposables | 23600894 | |
Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004271 | Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge |
Certified Timer | https://nist.time.gov/ | Not Applicable | |
Conical tubes (50 mL) | Corning Life Sciences | 352098 | Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes |
Cryovials | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AY509X33 | |
Denim | Wrangler | Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW | |
Detergent | Proctor and Gamble | Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068 | |
Dextrose | Fisher | BP350 | |
Dey-Engley neutralizing broth | Becton Dickinson | DF0819172 | |
Dryer | Magic Chef | MCSDRY15W | |
Face Coverings | Felina | Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4 | |
Incubator (top agar) | Symphony | 414004-596 | |
Laboratory Notebook | Scientific Notebook Company | 2001 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
Media sterilization and dispensing system | Integra | Media Clave/Media Jet | |
Petri Dishes (100 mm) | VWR | 25384-342 | |
pH Meter | Orion/Oakton | STARA1110/EW-35634-35 | |
pH Probe | Orion | 8157BNUMD | |
pH Standards | Oakton | 00654-(00/04/08) | |
Phi 6 and Pseudomonas syringae | Battelle Memorial Institute, Columbus, OH | Not Applicable | |
Pipette & Tips | Rainin | (Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382 | |
Refrigerator | True Manufacturing Co., Inc. | GDM-33 | |
Scrubs | Gogreen cool | PN: WS19100PT | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 57656 | |
Stir Bar | Fisherbrand | 16-800-512 | |
Tape Measure | Lufkin | PS3425 | |
Test Tubes for Soft agar (14 mL) | Corning, Corning, NY | 352059 | |
Thermometer | Fisherbrand | 14-983-19B | |
Tryptone | Sigma-Aldrich | T9410 | |
Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags | STERIS | 62020TW | |
Vortex (during the plating process) | Daigger Scientific, Inc | 3030A | Vortex Genie 2 |
Vortex (for sample extraction) | Branson Ultrasonics | 58816-115 | Multi-Tube vortexer |
Washer | Kuppet | KP1040600A | |
Washer Sterilization | Steris | STERIS VHP ED1000 generator | |
Yeast extract | Gibco | 212750 |