यहां, हम टेलोसाइट्स सहित मुराइन आंतों मेसेनकाइमल को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इनका उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जैसे कि माउस या मानव-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के साथ सह-संस्कृति, विकास का समर्थन करने और मूल ऊतक में स्थिति को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित करने के लिए।
मुराइन छोटी आंत, या बृहदान्त्र मेसेनकाइमल, अत्यधिक हेटरोजेनस है, जिसमें रक्त और लसीका एंडोथेलियम, नसों, फाइब्रोब्लास्ट्स, मायोफाइब्रोब्लास्ट्स, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और हाल ही में पहचाने गए सेल प्रकार, टेलोसाइट्स सहित अलग-अलग सेल प्रकार होते हैं। टेलोसाइट्स लंबी साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं के साथ अद्वितीय मेसेनकाइमल कोशिकाएं हैं, जो कोशिका शरीर से दसियों से सैकड़ों माइक्रोन की दूरी तक पहुंचती हैं। टेलोसाइट्स हाल ही में एक महत्वपूर्ण आंतों के स्टेम सेल आला घटक के रूप में उभरे हैं, जो डब्ल्यूएनटी प्रोटीन प्रदान करते हैं जो स्टेम और पूर्वज सेल प्रसार के लिए आवश्यक हैं।
यद्यपि माउस आंत से मेसेनचाइम को अलग करने के तरीके पर प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या ये प्रक्रियाएं टेलोसाइट्स के कुशल अलगाव की अनुमति देती हैं। टेलोसाइट्स को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए विशेष प्रोटोकॉल समायोजन की आवश्यकता होती है जो उनकी व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना टेलोसाइट्स और पड़ोसी कोशिकाओं के बीच मजबूत सेल-सेल संपर्क के पृथक्करण की अनुमति देगा। यहां, उपलब्ध आंतों के मेसेनचाइम अलगाव प्रोटोकॉल को मेसेनचाइम के सफल अलगाव और संस्कृति का समर्थन करने के लिए समायोजित किया गया था जिसमें व्यवहार्य एकल-कोशिका टेलोसाइट्स की अपेक्षाकृत उच्च उपज होती है।
प्राप्त एकल-सेल निलंबन का विश्लेषण कई तकनीकों द्वारा किया जा सकता है, जैसे इम्यूनोस्टेनिंग, सेल सॉर्टिंग, इमेजिंग और एमआरएनए प्रयोग। यह प्रोटोकॉल टेलोसाइट्स के पर्याप्त रूप से संरक्षित एंटीजेनिक और कार्यात्मक गुणों के साथ मेसेनचाइमल पैदा करता है, और इसका उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, उनका उपयोग माउस- या मानव-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के साथ सह-संस्कृति के लिए किया जा सकता है ताकि बिना किसी विकास कारक पूरक के ऑर्गेनोइड विकास का समर्थन किया जा सके, ताकि मूल ऊतक में स्थिति को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित किया जा सके।
स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण छोटी आंत और बृहदान्त्र दोनों अत्यधिक पुनर्योजी ऊतक हैं, जो प्रसार और ईंधन पुनर्जनन1. एपिथेलियम के आसपास का मेसेनकाइमल बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन और सिग्नलिंग अणुओं 2 को स्रावित करके संरचनात्मक और कार्यात्मक समर्थन प्रदान करता है, जो उपकला कोशिकाओं की प्रतिक्रिया कोसंशोधित करता है। टेलोसाइट्स बड़े मेसेनकाइमल कोशिकाएं हैं, जिन्हें मुख्य रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा टेलोपोड्स नामक लंबी साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं वाली कोशिकाओं के रूप में वर्णित किया गया है, जो एक भूलभुलैया नेटवर्क 3,4,5,6,7 बनाने के लिए ओवरलैप करते हैं। हाल ही में, प्रतिलेखन कारक FOXL1 को व्यक्त करने वाले आंतों के टेलोसाइट्स डब्ल्यूएनटी प्रोटीन प्रदान करने वाले एक महत्वपूर्ण स्टेम सेल आला घटक के रूप में उभरे हैं, जो स्टेम और पूर्वज सेल फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं। आंतों के टेलोसाइट्स प्रमुख सिग्नलिंग मार्ग प्रोटीन जैसे डब्ल्यूएनटी, बीएमपी, टीजीएफबी और एसएचएच के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं, साथ ही साथ कई विकास कारक8.
यह देखते हुए कि टेलोसाइट्स विवो में एक महत्वपूर्ण स्टेम सेल आला घटक हैं, उन्हें अलग करने और कल्चर करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने से विकास और भेदभाव का समर्थन करने के लिए अणुओं और विकास कारकों को संकेत देने के लिए एक स्रोत के रूप में उनका उपयोग करने की अनुमति मिलेगी। अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, बृहदान्त्र या आंतों के उपकला क्रिप्ट को अलग किया जा सकता है और 3 डी संरचनाओं का निर्माण किया जा सकता है जिन्हें ऑर्गेनोइड्स 9,10,11 के रूप में जाना जाता है। तीन आयामी ऑर्गेनोइड आंतों के उपकला एक्स विवो के शरीर विज्ञान और विकृति दोनों की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। एक पूर्व विवो प्रणाली में, ऑर्गेनोइड्स जीवित रहने और विकास के लिए कारकों के बहिर्जात पूरक पर भरोसा करतेहैं। पृथक मेसेनकाइमल को माउस और मानव-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स दोनों के साथ सुसंस्कृत किया जा सकता है और मूल ऊतक में स्थिति को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित करने के लिए बहिर्जात पूरकता के बजाय विकास कारकों के स्रोत के रूप में उपयोग किया जा सकता है। टेलोसाइट्स एक्स विवो का अध्ययन करने से सामान्य या पैथोलॉजिकल सेलुलर व्यवहार, ऊतक होमियोस्टेसिस के तंत्र और सेल-सेल इंटरैक्शन की जांच में कई लाभ होते हैं।
यद्यपि माउस आंत से मेसेनचाइम को अलग करने के तरीके का वर्णन करने वाले प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं, यह स्पष्ट नहीं है कि इन प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप टेलोसाइट्स का कुशल अलगाव होता है या नहीं। टेलोसाइट्स के सफल अलगाव के लिए विशेष प्रोटोकॉल समायोजन की आवश्यकता होती है जो उनकी व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना टेलोसाइट्स और पड़ोसी कोशिकाओं के बीच मजबूत सेल-सेल संपर्क के पृथक्करण की अनुमति देगा। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, यह पेपर एक संशोधित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो लगातार एक अत्यधिक व्यवहार्य, एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करता है जिसमें पर्याप्त रूप से संरक्षित एंटीजेनिक और कार्यात्मक गुणों के साथ अपेक्षाकृत उच्च मात्रा में टेलोसाइट्स होते हैं। इन टेलोसाइट्स का उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें माउस- या मानव-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के साथ सह-संस्कृति शामिल है, बिना किसी विकास कारक पूरक के विकास का समर्थन करने के लिए। यह बदले में मूल ऊतक में स्थिति को बेहतर ढंग से दर्शाता है।
हमने FOXL1-Cre: Rosa-mTmG माउस मॉडल8 का उपयोग किया, जिसमें टेलोसाइट्स को हरे रंग में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के झिल्ली-बाध्य संस्करण के साथ लेबल किया जाता है, जो अन्वेषक को उनकी संपूर्णता में टेलोसाइट्स का पालन करने की अनुमति देता है; अन्य सभी मेसेनकाइमल कोशिकाओं को लाल रंग में झिल्ली-बाध्य टीडीटोमेटो के साथ लेबल किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल को टेलोसाइट उपज और व्यवहार्यता में सुधार के लिए आंतों के मेसेनकाइमल12 को अलग करने वाले प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया था।
यहां, हमने FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG माउस मॉडल का उपयोग करके माउस छोटी आंत से मेसेनकाइमल को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया, जो शोधकर्ताओं को अन्य मेसेनकाइमल कोशिकाओं से टेलोसाइट्स को अलग करने में सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में पालन करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, मेसेनकाइमल अलगाव के दौरान उपकला कोशिकाओं के बहुमत को त्यागने के लिए, ट्यूब को चार या पांच चक्रों / सेकंड में जोर से हिलाना महत्वपूर्ण है। एंजाइमेटिक पाचन के लिए इनक्यूबेशन समय पाचन दक्षता के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। इनक्यूबेशन दौरान, प्लेटों को हर 20 मिनट में कुछ सेकंड के लिए क्षैतिज रूप से धीरे से हिलाया जाना है। एक बार जब ऊतक फिलामेंट जैसा हो जाता है, तो प्रोटोकॉल चरण 2.12 पर आगे बढ़कर इनक्यूबेशन को रोकना होगा। लंबे पाचन समय के लिए ऊतक को उजागर करने से कम सेल व्यवहार्यता दर और उपज हो सकती है। एंजाइमेटिक पाचन के बाद, ट्यूब को निलंबन में अधिक एकल कोशिकाओं को छोड़ने के लिए यांत्रिक रूप से हिलाया जाना चाहिए; आदर्श रूप से, समाधान बादल दिखना चाहिए, और कोई ऊतक टुकड़े दिखाई नहीं देना चाहिए। यदि ऐसा नहीं है, तो एंजाइमेटिक पाचन को 60 मिनट तक बढ़ाएं।
बाँझ स्थितियों को बनाए रखना और संभावित जीवाणु संदूषण से बचना प्राथमिक ऊतक संस्कृति के साथ काम करते समय महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। बाँझ विच्छेदन उपकरण, अभिकर्मकों और बफर का उपयोग किया जाना चाहिए; दस्ताने को बदला जाना चाहिए, और जानवरों के साथ काम करते समय कार्य क्षेत्र को साफ किया जाना चाहिए। एक बार सेल निलंबन प्राप्त हो जाने के बाद, काम एक लामिनार जैविक हुड के तहत आयोजित किया जाना चाहिए। चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं को बिना किसी गड़बड़ी के रात भर इनक्यूबेट किया जाना चाहिए, क्योंकि यह पालन को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, सीडिंग के एक दिन बाद संस्कृति माध्यम को बदलना महत्वपूर्ण है, क्योंकि गैर-अनुयायी कोशिकाएं संस्कृति व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकती हैं।
इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सतह मार्करों ने अपने एपिटोप्स के साथ दृढ़ता से प्रतिक्रिया व्यक्त की; हालांकि, यह संभव है कि एंजाइमेटिक पाचन बाध्यकारी प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है, और इसलिए, एफएसीएस विश्लेषण परिणाम। इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा मांसपेशियों की परत का कम प्रतिनिधित्व है। मांसपेशी परत सेल अलगाव की दक्षता में सुधार करने के लिए, हम म्यूकोसा परतों से मांसपेशियों के यांत्रिक पृथक्करण की सलाह देते हैं, और प्रत्येक परतों के लिए एंजाइमेटिक पाचन को अलग करते हैं। स्ट्रोमा से उपकला को अलग करने के लिए, या तो यांत्रिक पृथक्करण या चेलेटिंग एजेंट (ईडीटीए या डीटीटी) का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक पाचन को इस प्रोटोकॉल में अनुकूलित किया गया है।
आंतों के मेसेनचाइमल के अलगाव को पहले वर्णित किया गया है8; एक कवरस्लिप के साथ विली को स्क्रैप करने से विलस के साथ कुछ मेसेनचाइमल का नुकसान होगा, विशेष रूप से विलस टिप मेसेनकाइमल कोशिकाएं जैसे कि एलजीआर 5 + विलस टिप टेलोसाइट्स13। इस प्रोटोकॉल में, हम डीनेस I के साथ संयोजन में डिस्पेज़ II और ट्रिप्सिन के बजाय कोलेजनेज टाइप VIII का उपयोग करते हैं, क्योंकि कोलेजनेज मैट्रिक्स से मेसेनकाइमल कोशिकाओं को अधिक कुशलता से जारी करता है। यद्यपि यह प्रसंस्करण समय (>90 मिनट बनाम 35 मिनट) को बढ़ाता है, दो प्रोटोकॉल ने समान सेल व्यवहार्यता दर प्राप्त की; वर्तमान प्रोटोकॉल ने सामान्य रूप से मेसेनकाइमल कोशिकाओं की उपज में सुधार किया, और विशेष रूप से टेलोसाइट अंश। वर्तमान प्रोटोकॉल ने लगभग 10% जीएफपी + टेलोसाइट्स प्राप्त किए, जो विज़ुअलाइज़ेशन और एफएसीएस विश्लेषण दोनों द्वारा पुष्टि की गई, जबकि पहले के प्रोटोकॉल ने 2% जीएफपी + टेलोसाइट्स का उत्पादन किया। वर्तमान प्रोटोकॉल और दो संदर्भ प्रोटोकॉल के बीच प्रमुख अंतर पूरक तालिका एस 1 में सूचीबद्ध हैं।
एफओएक्सएल 1 + जीएफपी + कोशिकाओं की पहचान उपउपकला टेलोसाइट्स के रूप में विवो अध्ययनों पर आधारित है। टेलोसाइट्स की उच्च पैदावार का उत्पादन करने के लिए उपलब्ध मेसेनकाइमल अलगाव प्रोटोकॉल को विकसित करने और संशोधित करने की आवश्यकता, और इसे प्राप्त करने के तरीके का ज्ञान विवो में फॉक्सएल 1 + टेलोसाइट्स की संरचना और कार्य की हमारी समझ पर आधारित था, क्योंकि लंबे सेलुलर अनुमानों वाली बड़ी कोशिकाएं उपकला कोशिकाओं से निकटता से जुड़ी हुई थीं।
दिलचस्प बात यह है कि एक्स विवो जीएफपी + टेलोसाइट्स आंत में विवो में उनकी विशेषताओं के समान सेलुलर विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं और इसलिए, ऑर्गेनोइड विकास के लिए एक आदर्श समर्थन के रूप में सेवा करने का सुझाव दिया जाता है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल मुख्य रूप से छोटी आंत से टेलोसाइट अलगाव पर चर्चा करता है, मामूली संशोधन के साथ एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है और आसानी से बृहदान्त्र मेसेनकाइमल कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे कि हाल ही में वर्णित एमएपी 3 के 2-विनियमित आंतों के स्ट्रोमल सेल (एमआरआईएससी)12।
एक बार जब मेसेनकाइमल कोशिकाएं फैल जाती हैं और सामंजस्य तक पहुंच जाती हैं, तो उनका उपयोग कई अतिरिक्त अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जैसे कि माउस- या मानव-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के साथ 3 डी सह-संस्कृति, विकास कारक-मुक्त मैट्रिगेल का उपयोग करके। मेसेनकाइमल आमतौर पर एक नेटवर्क बनाता है जो पूरी तरह से ऑर्गेनोइड गठन और विकास का समर्थन करता है जिसमें कोई बहिर्जात विकास कारक पूरक नहीं होता है। आंतों के स्ट्रोमा में आंतरिक 3 डी विशेषताएं हैं जो उपकला को यांत्रिक सहायता14 प्रदान कर सकती हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग मेसेनचाइम को 3 डी बायो-प्रिंटेड पाड़ में एकीकृत करने के लिए अलग करने के लिए भी किया जा सकता है और आगे के जेनोग्राफ्ट प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को इज़राइल साइंस फाउंडेशन (एमएससी व्यक्तिगत अनुदान) और इज़राइल साइंस फाउंडेशन और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन के बीच संयुक्त कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
DNase I | Sigma | DN25-1G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |