여기에서 우리는 텔로세포를 포함한 쥐의 장 중간엽을 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이들은 마우스 또는 인간 유래 오가노이드와의 공동 배양과 같은 여러 응용 분야에 사용하여 성장을 지원하고 원래 조직의 상황을 더 잘 반영할 수 있습니다.
쥐의 소장 또는 결장 중간엽은 혈액 및 림프 내피, 신경, 섬유아세포, 근섬유아세포, 평활근 세포, 면역 세포 및 최근에 확인된 세포 유형인 텔로세포를 포함한 뚜렷한 세포 유형을 포함하는 매우 이질적입니다. 텔로세포는 세포질 과정이 긴 독특한 중간엽 세포로 세포체에서 수십에서 수백 미크론의 거리에 도달합니다. 텔로세포는 최근 줄기 및 전구 세포 증식에 필수적인 Wnt 단백질을 제공하는 중요한 장 줄기 세포 틈새 성분으로 부상했습니다.
마우스 장에서 중간엽을 분리하는 방법에 대한 프로토콜을 사용할 수 있지만 이러한 절차가 텔로세포의 효율적인 분리를 허용하는지 여부는 명확하지 않습니다. 텔로세포를 효율적으로 분리하려면 텔로세포와 인접 세포 사이의 강력한 세포-세포 접촉을 생존력에 영향을 미치지 않으면서 해리할 수 있는 특별한 프로토콜 조정이 필요합니다. 여기에서 사용 가능한 장 중간엽 분리 프로토콜은 상대적으로 높은 수율의 생존 가능한 단일 세포 텔로세포를 포함하는 중간엽의 성공적인 분리 및 배양을 지원하도록 조정되었습니다.
수득된 단세포 현탁액은 면역염색, 세포 분류, 이미징 및 mRNA 실험과 같은 여러 기술에 의해 분석될 수 있다. 이 프로토콜은 텔로세포의 충분히 보존된 항원 및 기능적 특성을 가진 중간엽을 생성하며 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 마우스 또는 인간 유래 오가노이드와의 공동 배양에 사용하여 성장 인자 보충 없이 오가노이드 성장을 지원하고 원래 조직의 상황을 더 잘 반영할 수 있습니다.
소장과 결장은 모두 줄기 세포의 존재로 인해 재생성이 높은 조직이며, 줄기 세포는 증식하고 재생을 촉진합니다1. 상피를 둘러싸고 있는 중간엽은 세포외 기질 단백질과 상피 세포의 반응을 조절하는 신호 분자2를 분비함으로써 구조적 및 기능적 지원을 제공한다. 텔로세포는 큰 중간엽 세포로, 지금까지 주로 전자 현미경으로 텔로포데스(telopodes)라고 하는 긴 세포질 과정을 가진 세포로 설명되었으며, 이 세포는 겹쳐서 미로 네트워크 3,4,5,6,7을 생성합니다. 최근에, 전사 인자 FOXL1을 발현하는 장내 텔로세포는 줄기 및 전구 세포 기능에 중요한 Wnt 단백질을 제공하는 중요한 줄기 세포 틈새 성분으로 부상하고 있다. 장내 텔로사이트는 Wnt, Bmp, Tgfb, Shh와 같은 주요 신호전달 경로 단백질과 많은 성장 인자를 발현한다8.
텔로세포가 생체 내에서 중요한 줄기 세포 틈새 구성 요소라는 점을 감안할 때, 생체 외에서 이들을 분리하고 배양하는 프로토콜을 개발하면 생체 외에서 성장과 분화를 지원하기 위해 신호 분자 및 성장 인자의 공급원으로 사용할 수 있습니다. 잘 확립된 프로토콜을 사용하여 결장 또는 장 상피 선와를 분리하고 오가노이드 9,10,11로 알려진 3D 구조를 형성할 수 있습니다. 3차원 오가노이드는 생체 외 장 상피의 생리학과 병리를 모두 조사하는 강력한 도구입니다. 생체 외 시스템에서 오가노이드는 생존 및 성장 인자의 외인성 보충에 의존한다10. 분리된 중간엽은 마우스 및 인간 유래 오가노이드 모두와 함께 배양할 수 있으며 원래 조직의 상황을 더 잘 반영하기 위해 외인성 보충 대신 성장 인자의 공급원으로 사용할 수 있습니다. 생체 외 텔로세포를 연구하면 정상 또는 병리학적 세포 행동, 조직 항상성 메커니즘 및 세포-세포 상호 작용을 더 자세히 조사하는 데 많은 이점이 있습니다.
마우스 장에서 중간엽을 분리하는 방법을 설명하는 프로토콜을 사용할 수 있지만 이러한 절차가 텔로세포의 효율적인 분리를 초래하는지 여부는 명확하지 않습니다. 텔로사이트의 성공적인 분리는 텔로세포와 인접 세포 사이의 강한 세포-세포 접촉의 해리를 허용하는 특별한 프로토콜 조정이 필요합니다., 생존력에 영향을 미치지 않으면서. 이러한 한계를 극복하기 위해 이 논문은 충분히 보존된 항원 및 기능적 특성을 가진 비교적 많은 양의 텔로세포를 포함하는 매우 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 일관되게 생성하는 수정된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 텔로세포는 성장 인자 보충 없이 성장을 지원하기 위해 마우스 또는 인간 유래 오가노이드와의 공동 배양을 포함한 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이것은 차례로 원래 조직의 상황을 더 잘 반영합니다.
우리는 FOXL1-Cre:Rosa-mTmG 마우스 모델8을 사용했는데, 여기서 텔로사이트는 녹색의 녹색 형광 단백질(GFP)의 막 결합 버전으로 표지되어 연구자가 텔로세포 전체를 추적할 수 있습니다. 다른 모든 중간엽 세포는 빨간색으로 막 결합된 tdTomato로 표시됩니다. 현재의 프로토콜은 텔로세포 수율 및 생존력을 향상시키기 위해 장 중간엽12 를 분리하는 프로토콜로부터 수정되었다.
여기에서 우리는 연구자들이 텔로세포를 다른 중간엽 세포와 구별할 수 있도록 하는 FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG 마우스 모델을 사용하여 마우스 소장에서 중간엽을 분리하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜에서 따라야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 중간엽 분리 중에 대부분의 상피 세포를 버리기 위해 4 또는 5 cycle/s에서 튜브를 세게 흔드는 것이 중요합니다. 효소 소화를 위한 배양 시간은 소화 효율에 따라 최적화되어야 합니다. 배양 동안, 플레이트는 매 20분마다 몇 초 동안 수평으로 부드럽게 흔들어져야 한다. 조직이 필라멘트와 같아지면 프로토콜 단계 2.12로 진행하여 배양을 중단해야 합니다. 긴 소화 시간 동안 조직을 노출시키면 세포 생존율과 수율이 낮아질 수 있습니다. 효소 소화 후, 튜브는 더 많은 단일 세포를 현탁액으로 방출하기 위해 기계적으로 흔들려야 합니다. 이상적으로는 용액이 흐리게 보이고 조직 조각이 보이지 않아야합니다. 그렇지 않은 경우 효소 소화를 60 분으로 연장하십시오.
멸균 상태를 유지하고 잠재적인 박테리아 오염을 피하는 것은 1차 조직 배양 작업을 할 때 중요한 단계 중 하나입니다. 멸균 해부 도구, 시약 및 완충액을 사용해야 합니다. 장갑을 교체해야하며 동물 작업을 할 때는 작업 영역을 청소해야합니다. 세포 현탁액이 얻어지면 층류 생물학적 후드 아래에서 작업을 수행해야합니다. 도금 후, 세포는 부착에 영향을 줄 수 있으므로 방해 없이 밤새 배양해야 합니다. 또한, 파종 후 하루 만에 배양액을 교체하는 것이 중요한데, 이는 비부착성 세포가 배양 생존율에 영향을 미칠 수 있기 때문이다.
이 프로토콜에 사용된 표면 마커는 에피토프와 강하게 반응했습니다. 그러나, 효소 분해가 결합 반응성에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 FACS 분석 결과에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜의 또 다른 한계는 근섬유층의 과소 표현입니다. 근육층 세포 분리의 효율성을 높이려면 점막층에서 근육을 기계적으로 분리하고 각 층에 대해 효소 분해를 분리하는 것이 좋습니다. 간질로부터 상피를 해리시키기 위해, 기계적 분리 또는 킬레이트 제 (EDTA 또는 DTT)가 사용될 수있다; 그러나, 단일 세포를 얻기 위한 효소 소화는 이 프로토콜에서 최적화되었다.
장 중간엽의 분리는 이전에 기술되었다8; 커버슬립으로 융모를 긁어내면 융모와 함께 일부 중간엽, 특히 Lgr5+ 융모 팁 텔로사이트(villus tip telocytes)와 같은 융모 팁 중간엽 세포가 손실될 수 있다13. 이 프로토콜에서는 콜라게나제가 매트릭스에서 중간엽 세포를 보다 효율적으로 방출하기 때문에 디스파제 II 대신 콜라게나제 유형 VIII와 트립신을 DNase I과 함께 사용합니다. 처리 시간(>90분 대 35분)이 길어지지만 두 프로토콜은 유사한 세포 생존율을 산출했습니다. 현재의 프로토콜은 일반적으로 중간엽 세포, 특히 텔로세포 분획의 수율을 향상시켰다. 현재 프로토콜은 약 10%의 GFP+ 텔로게이트를 생성했으며, 이는 시각화 및 FACS 분석에 의해 확인된 반면, 이전 프로토콜은 2% GFP+ 텔로게이트를 생성했습니다. 현재 프로토콜과 두 참조 프로토콜 간의 주요 차이점은 보충 표 S1에 나열되어 있습니다.
FOXL1+GFP+ 세포를 상피하 텔로세포로 식별하는 것은 생체 내 연구를 기반으로 합니다. 텔로세포의 더 높은 수율을 생산하기 위해 사용 가능한 중간엽 분리 프로토콜을 개발하고 수정해야 할 필요성과 이를 달성하는 방법에 대한 지식은 상피 세포에 밀접하게 부착된 긴 세포 돌기를 가진 큰 세포인 생체 내에서 FOXL1+ 텔로세포의 구조와 기능에 대한 이해를 기반으로 했습니다.
흥미롭게도, 생체 외 GFP+ 텔로세포는 장에서 생체 내 특징과 유사한 세포 특성을 나타내므로 오가노이드 성장에 대한 이상적인 지원 역할을 하는 것으로 제안됩니다. 이 프로토콜은 주로 소장에서 텔로세포 분리에 대해 논의하지만, 최근에 기술된 MAP3K2 조절 장 기질 세포(MRISC)12와 같이 약간의 변형이 있는 유사한 프로토콜을 사용할 수 있고 결장 중간엽 세포에 쉽게 적용할 수 있습니다.
중간엽 세포가 늘어나고 융합도에 도달하면 성장 인자 무함유 Matrigel을 사용하여 마우스 또는 인간 유래 오가노이드를 사용한 3D 공동 배양과 같은 몇 가지 추가 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 중간엽은 일반적으로 외인성 성장 인자 보충 없이 오가노이드 형성 및 성장을 완전히 지원하는 네트워크를 형성합니다. 장 기질은 상피에 기계적 지지를 제공할 수 있는 내재적 3D 특징을 가지고 있다(14). 따라서 이 프로토콜은 중간엽을 분리하여 3D 바이오 프린팅 스캐폴드에 통합하고 추가 이종이식 실험에 활용하는 데에도 사용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 이스라엘 과학 재단 (MSC 개인 보조금)의 보조금과 이스라엘 과학 재단과 중국 국립 자연 과학 재단 간의 공동 프로그램으로 지원되었습니다.
15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
DNase I | Sigma | DN25-1G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |