Apresentamos aqui um protocolo para isolar o mesênquima intestinal murino, incluindo telócitos. Estes podem ser usados para várias aplicações, tais como co-cultura com camundongos ou organoides derivados de humanos, para apoiar o crescimento e refletir melhor a situação no tecido original.
O intestino delgado murino, ou mesênquima do cólon, é altamente heterogêneo, contendo tipos celulares distintos, incluindo endotélio sanguíneo e linfático, nervos, fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, células imunes e o tipo celular recentemente identificado, telócitos. Os telócitos são células mesenquimais únicas com processos citoplasmáticos longos, atingindo uma distância de dezenas a centenas de mícrons do corpo celular. Recentemente, os telócitos emergiram como um importante componente de nicho de células-tronco intestinais, fornecendo proteínas Wnt essenciais para a proliferação de células-tronco e progenitoras.
Embora protocolos sobre como isolar o mesênquima do intestino de camundongos estejam disponíveis, não está claro se esses procedimentos permitem o isolamento eficiente dos telócitos. Isolar telócitos eficientemente requer ajustes especiais de protocolo que permitam dissociar o forte contato célula-célula entre telócitos e células vizinhas sem afetar sua viabilidade. Aqui, os protocolos de isolamento de mesênquima intestinal disponíveis foram ajustados para apoiar o isolamento e a cultura bem-sucedidos de mesênquima contendo um rendimento relativamente alto de telócitos unicelulares viáveis.
A suspensão unicelular obtida pode ser analisada por diversas técnicas, como imunomarcação, triagem celular, exames de imagem e experimentos de RNAm. Este protocolo produz mesênquima com propriedades antigênicas e funcionais dos telócitos suficientemente conservadas, podendo ser utilizado para diversas aplicações. Por exemplo, eles podem ser usados para co-cultura com organoides derivados de camundongos ou humanos para apoiar o crescimento de organoides sem suplementação de fator de crescimento, para refletir melhor a situação no tecido original.
Tanto o intestino delgado quanto o cólon são tecidos altamente regenerativos devido à presença de células-tronco, que proliferam e favorecem aregeneração1. O mesênquima que envolve o epitélio fornece suporte estrutural e funcional por meio da secreção de proteínas da matriz extracelular e moléculas sinalizadoras2, que modulam a resposta das células epiteliais. Os telócitos são células mesenquimais de grande porte, descritas principalmente pela microscopia eletrônica como células com processos citoplasmáticos longos denominados telópodes, que se sobrepõem para criar uma rede labiríntica3,4,5,6,7. Recentemente, telócitos intestinais expressando o fator de transcrição FOXL1 emergiram como um importante componente de nicho de células-tronco fornecendo proteínas Wnt, que são cruciais para a função das células-tronco e progenitoras. Os telócitos intestinais expressam altos níveis de proteínas-chave da via de sinalização, como Wnt, Bmp, Tgfb e Shh, bem como muitos fatores de crescimento8.
Dado que os telócitos são um componente crítico do nicho de células-tronco de vivo, o desenvolvimento de protocolos para isolá-los e cultivá-los ex vivo permitirá seu uso como fonte de sinalização de moléculas e fatores de crescimento, para apoiar o crescimento e diferenciação ex vivo. Utilizando protocolos bem estabelecidos, criptas epiteliais do cólon ou intestino podem ser isoladas e formar estruturas 3D conhecidas como organoides9,10,11. Os organoides tridimensionais representam uma poderosa ferramenta para investigar tanto a fisiologia quanto a patologia do epitélio intestinal ex vivo. Em um sistema ex vivo, os organoides dependem da suplementação exógena de fatores de sobrevivência e crescimento10. O mesênquima isolado pode ser cultivado com organoides derivados de camundongos e humanos e usado como fonte de fatores de crescimento, em vez de suplementação exógena, para melhor refletir a situação no tecido original. O estudo ex vivo dos telócitos traz inúmeros benefícios na investigação de comportamentos celulares normais ou patológicos, mecanismos de homeostase tecidual e interações célula-célula com maior detalhe.
Embora protocolos descrevendo como isolar o mesênquima do intestino de camundongos estejam disponíveis, não está claro se esses procedimentos resultam no isolamento eficiente de telócitos. O sucesso do isolamento dos telócitos requer ajustes especiais de protocolo que permitam dissociar o forte contato célula-célula entre os telócitos e as células vizinhas, sem afetar sua viabilidade. Para superar essas limitações, este trabalho apresenta um protocolo modificado que consistentemente produz uma suspensão unicelular altamente viável contendo uma quantidade relativamente alta de telócitos com propriedades antigênicas e funcionais suficientemente conservadas. Esses telócitos podem ser usados para várias aplicações, incluindo co-cultivo com organoides derivados de camundongos ou humanos, para apoiar o crescimento sem suplementação de fator de crescimento. Isso, por sua vez, reflete melhor a situação no tecido original.
Utilizou-se o camundongo FOXL1-Cre: Rosa-mTmG modelo8, no qual os telócitos são marcados com uma versão ligada à membrana da proteína fluorescente verde (GFP) em verde, o que permite ao investigador acompanhar os telócitos em sua totalidade; todas as outras células mesenquimais são marcadas com um tdTomato ligado à membrana em vermelho. O protocolo atual foi modificado a partir de um protocolo de isolamento do mesênquima intestinal12 para melhorar o rendimento e a viabilidade do telocita.
Aqui, desenvolvemos um protocolo para isolar o mesênquima do intestino delgado de camundongos usando o modelo de camundongo FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG, que permite aos pesquisadores distinguir telócitos de outras células mesenquimais. Existem alguns passos críticos a seguir neste protocolo. Primeiro, é importante agitar vigorosamente o tubo em quatro ou cinco ciclos/s, para descartar a maioria das células epiteliais durante o isolamento do mesênquima. O tempo de incubação para digestão enzimática deve ser otimizado com base na eficiência da digestão. Durante a incubação, as placas devem ser agitadas suavemente horizontalmente por alguns segundos a cada 20 min. Uma vez que o tecido se torna filamentoso, a incubação deve ser interrompida procedendo-se ao protocolo passo 2.12. A exposição do tecido por longos tempos de digestão pode resultar em baixa taxa de viabilidade celular e rendimento. Após a digestão enzimática, o tubo deve ser agitado mecanicamente para liberar mais células individuais em suspensão; Idealmente, a solução deve parecer turva e nenhum fragmento de tecido deve ser visível. Se este não for o caso, prolongue a digestão enzimática para 60 min.
Manter condições estéreis e evitar possíveis contaminações bacterianas é uma das etapas críticas quando se trabalha com cultura de tecidos primários. Devem ser utilizados ferramentas de dissecação estéreis, reagentes e tampões; as luvas devem ser trocadas e a área de trabalho deve ser limpa quando o trabalho com animais é feito. Uma vez obtida a suspensão celular, o trabalho deve ser realizado sob capuz biológico laminar. Após o plaqueamento, as células devem ser incubadas durante a noite sem distúrbios, pois isso pode afetar a adesão. Além disso, é importante substituir o meio de cultura um dia após a semeadura, uma vez que células não aderentes podem afetar a viabilidade da cultura.
Os marcadores de superfície utilizados neste protocolo reagiram fortemente com seus epítopos; no entanto, é possível que a digestão enzimática possa afetar a reatividade de ligação e, portanto, os resultados da análise FACS. Outra limitação desse protocolo é a sub-representação da camada muscular. Para melhorar a eficiência do isolamento celular da camada muscular, recomendamos a separação mecânica do músculo das camadas mucosas e a digestão enzimática separada para cada uma das camadas. Para dissociar o epitélio do estroma, pode-se utilizar separação mecânica ou agentes quelantes (EDTA ou TDT); no entanto, a digestão enzimática para a obtenção de células isoladas foi otimizada neste protocolo.
O isolamento do mesênquima intestinal já foi descritopreviamente8; raspar as vilosidades com um lamínulo causaria a perda de alguns mesênquimas ao lado das vilosidades, especialmente células mesenquimais da ponta das vilosidades, como os telócitos da ponta das vilosidades Lgr5+ 13. Neste protocolo, utilizamos colagenase tipo VIII em vez de dispase II e tripsina em combinação com DNase I, pois a colagenase libera mais eficientemente células mesenquimais da matriz. Embora prolongue o tempo de processamento (>90 min vs. 35 min), os dois protocolos produziram taxas de viabilidade celular semelhantes; O protocolo atual melhorou o rendimento das células mesenquimais em geral e, mais especificamente, da fração telocita. O protocolo atual produziu aproximadamente 10% de telócitos GFP+, confirmados tanto pela visualização quanto pela análise FACS, enquanto o protocolo anterior produziu telócitos GFP+ a 2%. As principais diferenças entre o protocolo atual e os dois protocolos de referência estão listadas na Tabela Suplementar S1.
A identificação de células FOXL1+GFP+ como telócitos subepiteliais é baseada em estudos in vivo . A necessidade de desenvolver e modificar os protocolos de isolamento de mesênquima disponíveis para produzir maiores rendimentos de telócitos, e o conhecimento de como conseguir isso foi baseado em nossa compreensão da estrutura e função dos telócitos FOXL1+ in vivo, como grandes células com longas projeções celulares intimamente ligadas às células epiteliais.
Curiosamente, os telócitos ex vivo da GFP+ exibem características celulares semelhantes às suas características in vivo no intestino e, portanto, são sugeridos para servir como um suporte ideal para o crescimento de organoides. Embora este protocolo discuta principalmente o isolamento de telocitos do intestino delgado, um protocolo semelhante com pequenas modificações pode ser usado e facilmente aplicado para células mesenquimais do cólon, como o recentemente descrito MAP3K2-regulated intestinal stromal cell (MRISC)12.
Uma vez que as células mesenquimais tenham se esticado e atingido a confluência, elas podem ser usadas para várias aplicações adicionais, como co-cultivo 3D com organoides derivados de camundongos ou humanos, usando Matrigel livre de fator de crescimento. O mesênquima tipicamente forma uma rede que suporta totalmente a formação e o crescimento de organoides sem suplementação de fator de crescimento exógeno. O estroma intestinal possui características 3D intrínsecas que podem fornecer suporte mecânico aoepitélio14. Portanto, este protocolo também pode ser usado para isolar o mesênquima para ser integrado em um arcabouço bioimpresso 3D e utilizado para experimentos posteriores com xenoenxerto.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Israel Science Foundation (MSC personal grant) e pelo programa conjunto entre a Israel Science Foundation e a National Natural Science Foundation of China.
15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
DNase I | Sigma | DN25-1G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |