Här presenterar vi ett protokoll för att isolera murin tarmmesenkym, inklusive telocyter. Dessa kan användas för flera tillämpningar, såsom samodling med mus eller organoider som härrör från människa, för att stödja tillväxt och bättre återspegla situationen i den ursprungliga vävnaden.
Den murina tunntarmen, eller kolonmesenkym, är mycket heterogen och innehåller distinkta celltyper inklusive blod och lymfatiskt endotel, nerver, fibroblaster, myofibroblaster, glattmuskelceller, immunceller och den nyligen identifierade celltypen, telocyter. Telocyter är unika mesenkymala celler med långa cytoplasmatiska processer och når ett avstånd av tiotals till hundratals mikron från cellkroppen. Telocyter har nyligen dykt upp som en viktig tarmstamcellsnischkomponent, vilket ger Wnt-proteiner som är väsentliga för stam- och stamcellsproliferation.
Även om protokoll om hur man isolerar mesenkym från musttarmen finns tillgängliga, är det inte klart om dessa förfaranden möjliggör effektiv isolering av telocyter. Att isolera telocyter effektivt kräver speciella protokolljusteringar som skulle möjliggöra dissociation av den starka cell-cellkontakten mellan telocyter och angränsande celler utan att påverka deras livskraft. Här justerades tillgängliga intestinala mesenkymisoleringsprotokoll för att stödja framgångsrik isolering och odling av mesenkym innehållande ett relativt högt utbyte av livskraftiga encelliga telocyter.
Den erhållna encellssuspensionen kan analyseras med flera tekniker, såsom immunfärgning, cellsortering, avbildning och mRNA-experiment. Detta protokoll ger mesenkym med tillräckligt bevarade antigena och funktionella egenskaper hos telocyter och kan användas för flera applikationer. Till exempel kan de användas för samodling med mus- eller human-härledda organoider för att stödja organoid tillväxt utan tillväxtfaktortillskott, för att bättre återspegla situationen i den ursprungliga vävnaden.
Både tunntarmen och tjocktarmen är mycket regenerativa vävnader på grund av närvaron av stamceller, som prolifererar och bränsleregenerering1. Mesenkymet som omger epitelet ger strukturellt och funktionellt stöd genom att utsöndra extracellulära matrisproteiner och signalmolekyler2, som modulerar epitelcellernas respons. Telocyter är stora mesenkymala celler, som hittills huvudsakligen beskrivits med elektronmikroskopi som celler med långa cytoplasmatiska processer som kallas telopoder, som överlappar varandra för att skapa ett labyrintiskt nätverk 3,4,5,6,7. Nyligen har intestinala telocyter som uttrycker transkriptionsfaktorn FOXL1 dykt upp som en viktig stamcellsnischkomponent som tillhandahåller Wnt-proteiner, som är avgörande för stam- och stamcellsfunktion. Intestinala telocyter uttrycker höga nivåer av viktiga signalvägsproteiner såsom Wnt, Bmp, Tgfb och Shh, liksom många tillväxtfaktorer8.
Med tanke på att telocyter är en kritisk stamcellsnischkomponent de vivo, kommer utveckling av protokoll för att isolera och odla dem ex vivo att tillåta deras användning som en källa för signalmolekyler och tillväxtfaktorer, för att stödja tillväxt och differentiering ex vivo. Med hjälp av väletablerade protokoll kan kolon- eller tarmepitelkrypter isoleras och bilda 3D-strukturer som kallas organoider 9,10,11. Tredimensionella organoider representerar ett kraftfullt verktyg för att undersöka både fysiologin och patologin i tarmepitelet ex vivo. I ett ex vivo-system förlitar sig organoider på exogent tillskott av faktorer för överlevnad och tillväxt10. Isolerat mesenkym kan odlas med både mus och humana organoider och användas som en källa till tillväxtfaktorer, istället för exogent tillskott, för att bättre återspegla situationen i den ursprungliga vävnaden. Att studera telocyter ex vivo har många fördelar med att undersöka normala eller patologiska cellulära beteenden, mekanismer för vävnadshomeostas och cell-cellinteraktioner mer detaljerat.
Även om protokoll som beskriver hur man isolerar mesenkym från musttarmen finns tillgängliga, är det inte klart om dessa procedurer resulterar i effektiv isolering av telocyter. Framgångsrik isolering av telocyter kräver speciella protokolljusteringar som möjliggör dissociation av den starka cellcellkontakten mellan telocyterna och angränsande celler utan att påverka deras livskraft. För att övervinna dessa begränsningar presenterar denna artikel ett modifierat protokoll som konsekvent ger en mycket livskraftig encellssuspension innehållande en relativt hög mängd telocyter med tillräckligt bevarade antigena och funktionella egenskaper. Dessa telocyter kan användas för flera tillämpningar, inklusive samodling med mus- eller human-derived organoider, för att stödja tillväxt utan tillväxtfaktor tillskott. Detta återspeglar i sin tur bättre situationen i den ursprungliga vävnaden.
Vi använde FOXL1-Cre: Rosa-mTmG musmodell8, där telocyter är märkta med en membranbunden version av grönt fluorescerande protein (GFP) i grönt, vilket gör det möjligt för utredaren att följa telocyter i sin helhet; alla andra mesenkymala celler är märkta med en membranbunden tdTomat i rött. Det nuvarande protokollet modifierades från ett protokoll som isolerar tarmmesenkym12 för att förbättra telocytutbytet och livskraften.
Här utvecklade vi ett protokoll för att isolera mesenkym från mustunntarmen med hjälp av FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG-musmodellen, vilket gör det möjligt för forskare att skilja telocyter från andra mesenkymala celler. Det finns några kritiska steg att följa i detta protokoll. För det första är det viktigt att skaka röret kraftigt vid fyra eller fem cykler / s, för att kassera majoriteten av epitelceller under mesenkymisolering. Inkubationstiden för enzymatisk nedbrytning måste optimeras baserat på matsmältningseffektivitet. Under inkubationen ska plattorna skakas försiktigt horisontellt i några sekunder var 20: e minut. När vävnaden blir filamentliknande måste inkubationen stoppas genom att gå vidare till protokollsteg 2.12. Att exponera vävnaden för långa matsmältningstider kan resultera i låg cellviabilitet och utbyte. Efter enzymatisk nedbrytning måste röret skakas mekaniskt för att frigöra fler enskilda celler i suspension; Helst bör lösningen se grumlig ut och inga vävnadsfragment ska vara synliga. Om så inte är fallet, förläng den enzymatiska nedbrytningen till 60 minuter.
Att hålla sterila förhållanden och undvika potentiell bakteriell kontaminering är ett av de kritiska stegen när man arbetar med primär vävnadsodling. Sterila dissekeringsverktyg, reagens och buffertar måste användas. Handskar måste bytas och arbetsområdet måste rengöras när arbetet med djur är klart. När cellsuspensionen har erhållits bör arbetet utföras under en laminär biologisk huva. Efter plätering bör cellerna inkuberas över natten utan störningar, eftersom detta kan påverka vidhäftningen. Dessutom är det viktigt att ersätta odlingsmediet en dag efter sådd, eftersom icke-vidhäftande celler kan påverka kulturens livskraft.
Ytmarkörer som används i detta protokoll reagerade starkt med sina epitoper; Det är dock möjligt att enzymatisk nedbrytning kan påverka bindningsreaktiviteten, och därmed FACS-analysresultat. En annan begränsning av detta protokoll är underrepresentationen av muscularisskiktet. För att förbättra effektiviteten av muskelskiktets cellisolering rekommenderar vi mekanisk separation av muskeln från slemhinnorna och separat enzymatisk nedbrytning för vart och ett av skikten. För att dissociera epitelet från stroma kan antingen mekaniska separations- eller kelatbildare (EDTA eller DTT) användas; Emellertid har enzymatisk matsmältning för att erhålla enskilda celler optimerats i detta protokoll.
Isolering av tarmmesenkym har tidigare beskrivits8; Skrapning av villi med ett täckglas skulle orsaka förlust av lite mesenkym tillsammans med villus, särskilt mesenkymala celler med villusspets som Lgr5+ villusspetstelocyter13. I detta protokoll använder vi kollagenas typ VIII istället för dispase II och trypsin i kombination med DNas I, eftersom kollagenas mer effektivt frigör mesenkymala celler från matrisen. Även om det förlänger bearbetningstiden (>90 min vs. 35 min), gav de två protokollen liknande cellviabilitetshastigheter; Det nuvarande protokollet förbättrade utbytet av mesenkymala celler i allmänhet och mer specifikt av telocytfraktionen. Det nuvarande protokollet gav cirka 10% GFP+ telocyter, bekräftat både genom visualisering och genom FACS-analys, medan det tidigare protokollet gav 2% GFP+ telocyter. De största skillnaderna mellan det nuvarande protokollet och de två referensprotokollen anges i tilläggstabell S1.
Identifieringen av FOXL1+GFP+ -celler som subepitelteltelocyter baseras på in vivo-studier . Behovet av att utveckla och modifiera tillgängliga mesenkymisoleringsprotokoll för att producera högre utbyten av telocyter, och kunskapen om hur man uppnår detta baserades på vår förståelse av strukturen och funktionen hos FOXL1 + telocyter in vivo, som stora celler med långa cellulära projektioner nära fästa vid epitelceller.
Intressant nog uppvisar ex vivo GFP+ telocyter cellulära egenskaper som liknar deras egenskaper in vivo i tarmen och föreslås därför fungera som ett idealiskt stöd för organoidtillväxt. Även om detta protokoll huvudsakligen diskuterar telocytisolering från tunntarmen, kan ett liknande protokoll med mindre modifiering användas och enkelt tillämpas för kolonmesenkymala celler, såsom den nyligen beskrivna MAP3K2-reglerade intestinala stromacellen (MRISC)12.
När mesenkymala celler har sträckt sig och nått sammanflöde kan de användas för flera ytterligare applikationer, såsom 3D-samkultur med mus- eller human-härledda organoider, med användning av tillväxtfaktorfri Matrigel. Mesenkymet bildar vanligtvis ett nätverk som fullt ut stöder organoidbildning och tillväxt utan exogent tillväxtfaktortillskott. Tarmstroma har inneboende 3D-funktioner som kan ge epitelet mekaniskt stöd14. Därför kan detta protokoll också användas för att isolera mesenkym som ska integreras i en 3D-biotryckt ställning och användas för ytterligare xenograftexperiment.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från Israel Science Foundation (MSC personligt bidrag) och det gemensamma programmet mellan Israel Science Foundation och National Natural Science Foundation of China.
15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
DNase I | Sigma | DN25-1G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |