यह प्रोटोकॉल लेजर माइक्रोडिसेक्शन का उपयोग करके हिस्टोलॉजी-हल सेल आबादी के संवर्धन के लिए सना हुआ, पतली ऊतक अनुभाग छवियों से ब्याज के पैथोलॉजी-पुष्टि क्षेत्रों के कृत्रिम बुद्धिमत्ता-संचालित विभाजन के लिए एक उच्च-थ्रूपुट वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। इस रणनीति में एक उपन्यास एल्गोरिथ्म शामिल है जो सीधे लेजर माइक्रोस्कोप में ब्याज की सेल आबादी को दर्शाते हुए सीमांकन के हस्तांतरण को सक्षम करता है।
ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) एक जटिल पारिस्थितिकी तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें ट्यूमर, स्ट्रोमा और प्रतिरक्षा कोशिका आबादी सहित दर्जनों अलग-अलग सेल प्रकार शामिल हैं। पैमाने पर प्रोटिओम-स्तरीय भिन्नता और ट्यूमर विषमता को चिह्नित करने के लिए, ठोस ट्यूमर दुर्दमताओं में असतत सेलुलर आबादी को चुनिंदा रूप से अलग करने के लिए उच्च-थ्रूपुट विधियों की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल कृत्रिम बुद्धिमत्ता (एआई) द्वारा सक्षम एक उच्च-थ्रूपुट वर्कफ़्लो का वर्णन करता है, जो लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) का उपयोग करके हिस्टोलॉजी-हल सेल आबादी की चयनात्मक फसल के लिए ब्याज के पैथोलॉजी-पुष्टि वाले क्षेत्रों में हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) -दाग, पतले ऊतक वर्गों की छवियों को खंडित करता है। इस रणनीति में एक उपन्यास एल्गोरिथ्म शामिल है जो ब्याज की सेल आबादी को दर्शाने वाले क्षेत्रों के हस्तांतरण को सक्षम करता है, डिजिटल छवि सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एनोटेट किया जाता है, सीधे लेजर माइक्रोस्कोप में, इस प्रकार अधिक आसान संग्रह को सक्षम करता है। इस वर्कफ़्लो का सफल कार्यान्वयन किया गया था, उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मात्रात्मक, मल्टीप्लेक्स प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए टीएमई से ट्यूमर सेल आबादी को चुनिंदा रूप से काटने के लिए इस सामंजस्यपूर्ण विधि की उपयोगिता का प्रदर्शन किया गया था। यह रणनीति नियमित हिस्टोपैथोलॉजी समीक्षा के साथ पूरी तरह से एकीकृत होती है, ब्याज की सेलुलर आबादी के संवर्धन का समर्थन करने के लिए डिजिटल छवि विश्लेषण का लाभ उठाती है और पूरी तरह से सामान्यीकृत है, मल्टीओमिक विश्लेषण के लिए टीएमई से सेल आबादी की सामंजस्यपूर्ण फसल को सक्षम करती है।
टीएमई एक जटिल पारिस्थितिकी तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है जो ट्यूमर कोशिकाओं, स्ट्रोमल कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं, अन्य मेसेनकाइमल सेल प्रकारों और एडिपोसाइट्स जैसे सेल प्रकारों की एक अत्यधिक विविध सरणी द्वारा आबाद है, साथ ही एक जटिल बाह्य मैट्रिक्स1. यह सेलुलर पारिस्थितिकी तंत्र विभिन्न रोग अंग साइटों के भीतर और पार भिन्न होता है, जिसके परिणामस्वरूप जटिल ट्यूमर विषमता 2,3 होती है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि कम ट्यूमर सेलुलरिटी (कम शुद्धता) वाले विषम ट्यूमर और ट्यूमर अक्सर खराब रोग निदान 2,3 के साथ सहसंबंधित होते हैं।
पैमाने पर टीएमई के भीतर ट्यूमर और गैर-ट्यूमर सेल आबादी के बीच आणविक परस्पर क्रिया को समझने के लिए, डाउनस्ट्रीम मल्टीओमिक विश्लेषण के लिए ब्याज की अलग-अलग सेलुलर आबादी को चुनिंदा रूप से फसल करने के लिए मानकीकृत और उच्च-थ्रूपुट रणनीतियों की आवश्यकता होती है। मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स कैंसर जीव विज्ञान की समझ को आगे बढ़ाने के लिए तेजी से विकसित और तेजी से महत्वपूर्ण तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है। आज तक, प्रोटिओमिक्स को नियोजित करने वाले अध्ययनों की प्रधानता ने पूरे ट्यूमर ऊतक की तैयारी (जैसे, क्रायोपुल्वराइज्ड) से निकाले गए प्रोटीन के साथ ऐसा किया है, जिससे टीएमई 4,5,6 में प्रोटिओम-स्तर की विषमता की समझ में कमी आई है।
नमूना संग्रह रणनीतियों का विकास जो नैदानिक पैथोलॉजी वर्कफ़्लोज़ से जानकारी के साथ मूल रूप से एकीकृत और दोहन करता है, हिस्टोलॉजी-हल किए गए प्रोटिओमिक्स की एक नई पीढ़ी को सक्षम करेगा जो स्वर्ण-मानक, नैदानिक पैथोलॉजी वर्कफ़्लो के अत्यधिक पूरक हैं। एलएमडी हिस्टोलॉजिकल रूप से दाग ऊतक पतले वर्गों के सूक्ष्म निरीक्षण के माध्यम से सेलुलर उप-जनसंख्या या ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) के प्रत्यक्ष और चयनात्मक संग्रह को सक्षम बनाता है7. डिजिटल पैथोलॉजी और एआई-सक्षम विश्लेषण में हालिया प्रमुख प्रगति ने स्वचालित फैशन में टीएमई के भीतर अद्वितीय रचनात्मक विशेषताओं और आरओआई की पहचान करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है, जिनमें से कई आणविक परिवर्तन और नैदानिक रोग सुविधाओं के साथ सहसंबंधित हैं, जैसे कि चिकित्सा और रोग का निदान8 के प्रतिरोध।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में वर्णित वर्कफ़्लो डिजिटल हिस्टोपैथोलॉजी छवियों के भीतर ट्यूमर आरओआई को चुनिंदा रूप से एनोटेट करने के लिए वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर समाधानों का लाभ उठाता है, और इन ट्यूमर आरओआई को ब्याज की असतत सेलुलर आबादी के स्वचालित संग्रह के लिए लेजर माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित करने के लिए इन-हाउस विकसित सॉफ़्टवेयर टूल का उपयोग करता है जो डाउनस्ट्रीम मल्टीओमिक विश्लेषण वर्कफ़्लो के साथ मूल रूप से एकीकृत होता है। यह एकीकृत रणनीति एलएमडी ऑपरेटर समय को काफी कम कर देती है और उस अवधि को कम करती है जिसके लिए ऊतकों को परिवेश के तापमान पर होना आवश्यक है। उच्च थ्रूपुट मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के साथ स्वचालित सुविधा चयन और एलएमडी फसल का एकीकरण दो प्रतिनिधि उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर हिस्टोलॉजिकल उपप्रकारों, उच्च ग्रेड सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर (एचजीएसओसी) और डिम्बग्रंथि स्पष्ट सेल कार्सिनोमा (ओसीसीसी) से टीएमई के अंतर विश्लेषण के माध्यम से प्रदर्शित किया जाता है।
हालांकि एफएफपीई और/या ताजा जमे हुए ऊतकों से लक्ष्य सेलुलर उप-जनसंख्या के संवर्धन के लिए वर्कफ़्लो को विकसित करने और / या सुधारने के उद्देश्य से कई अध्ययन मिसालें हैं और प्रसंस्करण 9,12,13,14,15 के दौरान नमूना गुणवत्ता बनाए रखने के तरीके, परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए आणविक विश्लेषण के लिए नैदानिक ऊतक नमूने तैयार करने के लिए स्वचालित रणनीतियों को विकसित करने की पर्याप्त आवश्यकता है और प्रजनन क्षमता में वृद्धि। यह वर्कफ़्लो एक मानकीकृत, अर्धस्वचालित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो नैदानिक ऊतक नमूनों से एलएमडी द्वारा असतत सेल आबादी की ऊतक विज्ञान-हल फसल के लिए मौजूदा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर टूल (सामग्री की तालिका देखें) को एकीकृत करता है।
असतत सेल आबादी पर कब्जा करने वाले आरओआई के स्थानिक रूप से हल किए गए एलएमडी संवर्धन आणविक लक्षण वर्णन और पहचान में सुधार और सेल-चयनात्मक बायोमार्कर खोज की सुविधा के लिए मल्टीओमिक विश्लेषण से पहले अगली पीढ़ी के ऊतक प्रसंस्करण चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह प्रोटोकॉल परिवेश पर्यावरण के लिए ऊतक वर्गों के अक्सर लंबे जोखिम को कम करके मौजूदा तरीकों में सुधार करता है जो एक हिस्टोलॉजिस्ट द्वारा आरओआई के मैनुअल विभाजन से जुड़ा होता है (जो एलएमडी संग्रह से पहले >1-2 घंटे लग सकता है)। यह वर्कफ़्लो इसके बजाय आरओआई को एआई-निर्देशित वर्गीकरण और विभाजन द्वारा पूर्व-पहचानने की अनुमति देता है। ऊतक निवास समय को सीमित करने से अत्यधिक लेबिल आणविक लक्ष्यों, जैसे फॉस्फोपेप्टाइड्स और एमआरएनए, या एंटीबॉडी-आधारित विश्लेषणात्मक तकनीकों के आकलन में नकली विविधताएं कम हो जाएंगी जो पता लगाने के लिए अपने मूल विरूपण में लक्ष्य प्रोटीन पर भरोसा करती हैं।
स्कैन की गई स्लाइड छवि में स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली पेन झिल्ली स्लाइड पर स्वच्छ कैलिब्रेटर फिड्यूशियल काटना एलएमडी वर्कफ़्लो के साथ छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) के एकीकरण को सक्षम करने वाले प्रमुख घटकों में से एक है। यह सुनिश्चित करना कि कैलिब्रेटर में “वी” आकार के तल पर एक सटीक (“स्वच्छ”) बिंदु है, कैलिब्रेटर लाइनों के लिए छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में एक सटीक बिंदु के चयन की अनुमति देता है, जैसा कि चरण 5.1.6 और 5.2.13 में वर्णित है। एलएमडी सॉफ़्टवेयर में आयात के दौरान इन बिंदुओं का संरेखण भौतिक एलएमडी स्लाइड पर प्रासंगिक ऊतक आरओआई पर एनोटेशन (“मैलेटर” और / या “डैप” एल्गोरिदम का उपयोग करके संगत .xml फ़ाइल की पीढ़ी के माध्यम से सुविधाजनक) को ठीक से ओवरले करने के लिए महत्वपूर्ण है। लेजर माइक्रोस्कोप पर स्लाइड चरण की ऊर्ध्वाधर (जेड-प्लेन) स्थिति को पंजीकृत करने के लिए एलएमडी सॉफ़्टवेयर में आयात पर संरेखण सटीक होने पर भी सभी आकृतियों और सामूहिक रूप से “ड्रैग एंड ड्रॉप” को उजागर करना आवश्यक है। यदि आवश्यक हो, तो इस चरण के दौरान ऊतक आरओआई पर एनोटेशन की स्थिति में मामूली समायोजन भी किया जा सकता है।
मैलेटर एल्गोरिथ्म के वर्तमान संस्करण की एक सीमा यह है कि यह छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए पूर्वनिर्धारित एनोटेशन आकार उपकरणों के साथ संगत नहीं है ( सामग्री की तालिका देखें), हालांकि एल्गोरिथ्म के भविष्य के अपडेट / इन उपकरणों का उपयोग करके खींची गई आकृतियों के लिए .एनोटेशन फ़ाइल में उन बिंदुओं के आसपास पूर्ण स्थानिक अभिविन्यास के बिना, प्रत्येक एनोटेशन के लिए युग्मित एक्स और वाई निर्देशांक के केवल दो सेट होते हैं। इन उपकरणों के वर्तमान उपयोग के परिणामस्वरूप आयात प्रक्रिया के दौरान केवल दो बिंदुओं द्वारा परिभाषित सीधी रेखाओं में एनोटेशन परिवर्तित हो जाते हैं। एक्सएमएल प्रारूप और एलएमडी आयात में सफल रूपांतरण के लिए ऊतक आरओआई खंडों की मैनुअल परिभाषा आवश्यक है। यह या तो लक्ष्य क्षेत्र के लिए विशिष्ट व्यक्तिगत फ्री-हैंड बहुभुज एनोटेशन के साथ प्रत्येक आरओआई को मैन्युअल रूप से परिभाषित करके या वांछित होने पर सभी ऊतक आरओआई खंडों में अनुमानित परिपत्र या आयताकार एनोटेशन लागू करके किया जा सकता है, और इस वर्कफ़्लो के साथ संगत होगा।
जबकि यहां प्रस्तुत वर्कफ़्लो को ताजा जमे हुए मानव कैंसर ऊतक नमूनों के प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए प्रदर्शित किया गया था, इस एआई-संचालित एलएमडी वर्कफ़्लो का उपयोग एफएफपीई ऊतकों, गैर-कैंसर ऊतक प्रकारों और गैर-मानव स्रोतों के साथ समान रूप से किया जा सकता है। यह ट्रांसक्रिप्टोमिक, जीनोमिक या फॉस्फोप्रोटिओमिक विश्लेषण सहित अन्य डाउनस्ट्रीम आणविक प्रोफाइलिंग वर्कफ़्लो का भी समर्थन कर सकता है। यह वर्कफ़्लो छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के अन्य उपयोगों का भी लाभ उठा सकता है ( सामग्री की तालिका देखें), जिसमें सेल गिनती या अन्य विश्लेषणात्मक मॉड्यूल से जुड़ी क्षमताएं शामिल हैं, जिनमें “मल्टीप्लेक्स आईएचसी” मॉड्यूल या “टिशू माइक्रोएरे (टीएमए) ऐड-ऑन” शामिल हैं। इस वर्कफ़्लो के भविष्य के अनुप्रयोगों को आरओआई सेगमेंट प्रति कोशिकाओं की संख्या को पूर्वनिर्धारित करने से भी लाभ हो सकता है, जिससे कई संग्रहों में समतुल्य सेलुलर इनपुट सुनिश्चित हो सकते हैं, या ब्याज के सेलुलर आरओआई को परिभाषित करने के लिए वैकल्पिक तरीकों का उपयोग करके, जैसे कि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या सेल समाजशास्त्र।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना के लिए वित्त पोषण रक्षा स्वास्थ्य कार्यक्रम (एचयू0001-16-2-0006 और एचयू0001-16-2-00014) द्वारा स्त्री रोग कैंसर उत्कृष्टता केंद्र के लिए वर्दीधारी सेवा विश्वविद्यालय को प्रदान किया गया था। अध्ययन के डिजाइन, निष्पादन, व्याख्या या लेखन में प्रायोजकों की कोई भूमिका नहीं थी। अस्वीकरण: यहां व्यक्त किए गए विचार लेखकों के हैं और सेना / नौसेना / वायु सेना विभाग, रक्षा विभाग या अमेरिकी सरकार की आधिकारिक नीति को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं।
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |