Isolering og direkte neuronal omprogrammering af muse-astrocytter
Summary
Her beskriver vi en detaljeret protokol til at generere højt berigede kulturer af astrocytter afledt af forskellige regioner i centralnervesystemet hos postnatale mus og deres direkte omdannelse til funktionelle neuroner ved tvungen ekspression af transkriptionsfaktorer.
Abstract
Direkte neuronal omprogrammering er en kraftfuld tilgang til at generere funktionelle neuroner fra forskellige startcellepopulationer uden at passere gennem multipotente mellemprodukter. Denne teknik har ikke kun store løfter inden for sygdomsmodellering, da den gør det muligt at konvertere for eksempel fibroblaster til patienter, der lider af neurodegenerative sygdomme til neuroner, men repræsenterer også et lovende alternativ til cellebaserede erstatningsterapier. I denne sammenhæng var et stort videnskabeligt gennembrud demonstrationen af, at differentierede ikke-neurale celler i centralnervesystemet, såsom astrocytter, kunne omdannes til funktionelle neuroner in vitro. Siden da har in vitro direkte omprogrammering af astrocytter til neuroner givet betydelig indsigt i de molekylære mekanismer, der ligger til grund for tvungen identitetskonvertering og de forhindringer, der forhindrer effektiv omprogrammering. Resultater fra in vitro-forsøg udført i forskellige laboratorier er imidlertid vanskelige at sammenligne på grund af forskelle i de metoder, der anvendes til at isolere, dyrke og omprogrammere astrocytter. Her beskriver vi en detaljeret protokol til pålidelig isolering og dyrkning af astrocytter med høj renhed fra forskellige regioner i musens centralnervesystem i postnatale aldre via magnetisk cellesortering. Desuden leverer vi protokoller til omprogrammering af dyrkede astrocytter til neuroner via viral transduktion eller DNA-transfektion. Denne strømlinede og standardiserede protokol kan bruges til at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger til grund for vedligeholdelse af celleidentitet, etablering af en ny neuronal identitet samt generering af specifikke neuronale undertyper og deres funktionelle egenskaber.
Introduction
Pattedyrs centralnervesystem (CNS) er meget komplekst og består af hundredvis af forskellige celletyper, herunder et stort antal forskellige neuronale undertyper 1,2,3,4,5,6. I modsætning til andre organer eller væv 7,8,9 har pattedyrets CNS en meget begrænset regenerativ kapacitet; neuronalt tab efter traumatisk hjerneskade eller neurodegeneration er irreversibel og resulterer ofte i motoriske og kognitive underskud10. Med det formål at redde hjernefunktioner er forskellige strategier til erstatning af tabte neuroner under intens undersøgelse11. Blandt dem fremstår direkte omprogrammering af somatiske celler til funktionelle neuroner som en lovende terapeutisk tilgang12. Direkte omprogrammering eller transdifferentiering er processen med at konvertere en differentieret celletype til en ny identitet uden at passere gennem en mellemliggende proliferativ eller pluripotent tilstand 13,14,15,16. Banebrydende ved identifikation af MyoD1 som en faktor, der er tilstrækkelig til at omdanne fibroblaster til muskelceller17,18, er denne metode med succes blevet anvendt til at omprogrammere flere celletyper til funktionelle neuroner 19,20,21.
Astrocytter, den mest rigelige makroglia i CNS 22,23, er en særlig lovende celletype til direkte neuronal omprogrammering af flere grunde. For det første er de bredt og jævnt fordelt over CNS, hvilket giver en rigelig i loco kilde til nye neuroner. For det andet er astrocytter og neuroner udviklingsmæssigt nært beslægtede, da de deler en fælles forfader under embryonal udvikling, de radiale gliaceller24. Den fælles embryonale oprindelse af de to celletyper synes at lette neuronal konvertering sammenlignet med omprogrammering af celler fra forskellige kimlag19,21. Desuden opretholdes mønsterinformation arvet af astrocytter gennem deres radiale glia-oprindelse også i voksne astrocytter 25,26,27 og synes at bidrage til dannelsen af regionalt passende neuronale subtyper 28,29,30. Derfor er undersøgelse og forståelse af omdannelsen af astrocytter til neuroner en vigtig del af at opnå det fulde potentiale af denne teknik til cellebaserede udskiftningsstrategier.
Omdannelsen af in vitro-dyrkede astrocytter til neuroner har ført til flere gennembrud inden for direkte neuronal omprogrammering, herunder: i) identifikation af transkriptionsfaktorer, der er tilstrækkelige til at generere neuroner fra astrocytter 15,19,31, ii) optrævling af molekylære mekanismer udløst af forskellige omprogrammeringsfaktorer i samme cellulære kontekst32 , og iii) fremhæve virkningen af astrocytternes udviklingsmæssige oprindelse på inducering af forskellige neuronale undertyper 28,29,33. Desuden afslørede in vitro direkte omdannelse af astrocytter flere store forhindringer, der begrænser direkte neuronal omprogrammering34,35, såsom øget reaktiv iltart (ROS) produktion34 og forskelle mellem mitokondrieproteomet af astrocytter og neuroner35. Derfor understøtter disse observationer stærkt brugen af primære kulturer af astrocytter som en model for direkte neuronal omprogrammering for at undersøge flere grundlæggende spørgsmål i biologi12, relateret til vedligeholdelse af celleidentitet, vejspærringer, der forhindrer celleskæbneændringer, samt metabolismens rolle i omprogrammering.
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til isolering af astrocytter fra mus i postnatal (P) alder med meget høj renhed, som demonstreret ved at isolere astrocytter fra murin rygmarven29. Vi leverer også protokoller til omprogrammering af astrocytter til neuroner via viral transduktion eller DNA-plasmidtransfektion. Omprogrammerede celler kan analyseres 7 dage efter transduktion (7 DPT) for at vurdere forskellige aspekter, såsom omprogrammeringseffektivitet og neuronal morfologi, eller kan opretholdes i kultur i flere uger for at vurdere deres modning over tid. Det er vigtigt, at denne protokol ikke er specifik for rygmarvsastrocytter og let kan anvendes til at isolere astrocytter fra forskellige andre hjerneområder, herunder kortikale grå substans, mellemhjerne og cerebellum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primære kulturer af murin astrocytter er et bemærkelsesværdigt in vitro-modelsystem til at studere direkte neuronal omprogrammering. På trods af at de er isoleret på et postnatalt stadium, udtrykker celler faktisk typiske astrocytmarkører29, bevarer ekspressionen af mønstrende gener28,29 og opretholder evnen til at proliferere, svarende til in vivo astrocytter i en sammenlignelig alder38. Ef…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Ines Mühlhahn for kloning af konstruktionerne til omprogrammering, Paulina Chlebik for viral produktion og Magdalena Götz og Judith Fischer-Sternjak for kommentarer til manuskriptet.
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
Referências
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
- Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).
- Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration – a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
- Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
- Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
- Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).
- Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
- Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).
- Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
- Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).
- Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
- Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).
- Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
- Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
- Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
- Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).
