בידוד ותכנות מחדש ישיר של נוירונים של אסטרוציטים של עכברים
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליצירת תרביות מועשרות מאוד של אסטרוציטים שמקורם באזורים שונים במערכת העצבים המרכזית של עכברים לאחר הלידה ואת המרתם הישירה לנוירונים פונקציונליים על ידי ביטוי כפוי של גורמי שעתוק.
Abstract
תכנות מחדש ישיר של תאי העצב הוא גישה רבת עוצמה ליצירת נוירונים פונקציונליים מאוכלוסיות שונות של תאי מתחילים מבלי לעבור דרך מתווכים רב-תכליתיים. טכניקה זו לא רק טומנת בחובה הבטחות גדולות בתחום מודל המחלות, שכן היא מאפשרת להמיר, למשל, פיברובלסטים לחולים הסובלים ממחלות נוירודגנרטיביות לנוירונים, אלא גם מייצגת אלטרנטיבה מבטיחה לטיפולים חלופיים מבוססי תאים. בהקשר זה, פריצת דרך מדעית משמעותית הייתה ההדגמה כי תאים לא עצביים מובחנות בתוך מערכת העצבים המרכזית, כגון אסטרוציטים, יכולים להיות מומרים לנוירונים פונקציונליים במבחנה. מאז, תכנות מחדש ישיר במבחנה של אסטרוציטים לנוירונים סיפק תובנות משמעותיות לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס המרת זהות כפויה והמכשולים המונעים תכנות מחדש יעיל. עם זאת, קשה להשוות בין תוצאות מניסויים במבחנה שבוצעו במעבדות שונות בשל הבדלים בשיטות המשמשות לבידוד, תרבית ותכנות מחדש של אסטרוציטים. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד אמין ולתרבית של אסטרוציטים עם טוהר גבוה מאזורים שונים במערכת העצבים המרכזית של עכברים בגילאים שלאחר הלידה באמצעות מיון תאים מגנטיים. יתר על כן, אנו מספקים פרוטוקולים לתכנות מחדש של אסטרוציטים בתרבית לתאי עצב באמצעות התמרה נגיפית או טרנספקציה של דנ”א. פרוטוקול יעיל וסטנדרטי זה יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תחזוקת זהות התא, את קביעת הזהות העצבית החדשה, כמו גם את יצירתם של תת-סוגים עצביים ספציפיים ואת תכונותיהם התפקודיות.
Introduction
מערכת העצבים המרכזית של היונקים (CNS) מורכבת מאוד, המורכבת ממאות סוגי תאים שונים, כולל מספר עצום של תת-סוגים עצביים שונים 1,2,3,4,5,6. שלא כמו איברים או רקמות אחרים 7,8,9, ליונק CNS יש יכולת התחדשות מוגבלת מאוד; אובדן עצבי בעקבות פגיעה מוחית טראומטית או ניוון עצבי הוא בלתי הפיך ולעתים קרובות גורם לליקויים מוטוריים וקוגניטיביים10. במטרה להציל את תפקודי המוח, אסטרטגיות שונות להחלפת תאי עצב אבודים נמצאות תחת חקירה אינטנסיבית11. ביניהם, תכנות מחדש ישיר של תאים סומטיים לנוירונים פונקציונליים מתגלה כגישה טיפולית מבטיחה12. תכנות מחדש ישיר, או טרנסדיפרנציה, הוא תהליך של המרת סוג תא מובחן אחד לזהות חדשה מבלי לעבור דרך מצב התפשטות ביניים או פלוריפוטנטי 13,14,15,16. שיטה זו, שהומצאה על ידי זיהוי של MyoD1 כגורם מספיק כדי להמיר פיברובלסטים לתאי שריר17,18, יושמה בהצלחה כדי לתכנת מחדש מספר סוגי תאים לנוירונים פונקציונליים 19,20,21.
אסטרוציטים, המקרוגליה הנפוצה ביותר במערכת העצבים המרכזית 22,23, הם סוג תא מבטיח במיוחד לתכנות מחדש ישיר של העצבים מכמה סיבות. ראשית, הם מופצים באופן נרחב ושווה על פני מערכת העצבים המרכזית, ומספקים מקור לוקו בשפע לנוירונים חדשים. שנית, אסטרוציטים ותאי עצב קשורים זה לזה מבחינה התפתחותית, שכן הם חולקים אב קדמון משותף במהלך ההתפתחות העוברית, תאי הגלייה הרדיאליים24. נראה כי המקור העוברי הנפוץ של שני סוגי התאים מקל על המרה עצבית בהשוואה לתכנות מחדש של תאים משכבות נבט שונות19,21. יתר על כן, דפוס מידע שעובר בירושה על ידי אסטרוציטים באמצעות מקור הגליה הרדיאלי שלהם נשמר גם אצל אסטרוציטים בוגרים 25,26,27, ונראה שהוא תורם ליצירת תת-סוגים עצביים מתאימים אזורית 28,29,30. לפיכך, חקר והבנת ההמרה של אסטרוציטים לנוירונים היא חלק חשוב בהשגת מלוא הפוטנציאל של טכניקה זו לאסטרטגיות החלפה מבוססות תאים.
ההמרה של אסטרוציטים בתרבית חוץ גופית לנוירונים הובילה למספר פריצות דרך בתחום התכנות מחדש של נוירונים ישירים, כולל: 1) זיהוי גורמי שעתוק מספיקים כדי ליצור נוירונים מאסטרוציטים 15,19,31, ii) חשיפת מנגנונים מולקולריים המופעלים על ידי גורמי תכנות מחדש שונים באותו הקשר תאי 32 ו-3) הדגשת ההשפעה של המקור ההתפתחותי של האסטרוציטים על גרימת תת-סוגים עצביים שונים 28,29,33., יתר על כן, המרה ישירה במבחנה של אסטרוציטים פענחה מספר מכשולים עיקריים המגבילים תכנות מחדש של נוירונים ישירים34,35, כגון ייצור מוגבר של מיני חמצן תגובתי (ROS)34 והבדלים בין הפרוטאום המיטוכונדריאלי של אסטרוציטים ותאי עצב35. לפיכך, תצפיות אלה תומכות מאוד בשימוש בתרביות ראשוניות של אסטרוציטים כמודל לתכנות מחדש של נוירונים ישירים כדי לחקור מספר שאלות יסוד בביולוגיה12, הקשורות לתחזוקת זהות התא, מחסומים המונעים שינויים בגורל התא, כמו גם תפקידו של חילוף החומרים בתכנות מחדש.
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד אסטרוציטים מעכברים בגיל שלאחר הלידה (P) עם טוהר גבוה מאוד, כפי שהודגם על ידי בידוד אסטרוציטים מחוט השדרה של מורין29. אנו גם מספקים פרוטוקולים לתכנות מחדש של אסטרוציטים לנוירונים באמצעות התמרה נגיפית או טרנספקציה של פלסמיד דנ”א. ניתן לנתח תאים מתוכנתים מחדש לאחר 7 ימים לאחר ההעתקה (7 DPT) כדי להעריך היבטים שונים, כגון יעילות תכנות מחדש ומורפולוגיה עצבית, או שניתן לשמור עליהם בתרבית במשך מספר שבועות, כדי להעריך את ההתבגרות שלהם לאורך זמן. חשוב לציין שפרוטוקול זה אינו ספציפי לאסטרוציטים של חוט השדרה וניתן ליישם אותו בקלות כדי לבודד אסטרוציטים מאזורים שונים אחרים במוח, כולל החומר האפור בקליפת המוח, המוח האמצעי והמוח הקטן.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרביות ראשוניות של אסטרוציטים של מורין הן מערכת מודלים יוצאת דופן במבחנה לחקר תכנות מחדש של נוירונים ישירים. למעשה, למרות היותם מבודדים בשלב שלאחר הלידה, תאים מבטאים סמני אסטרוציטים טיפוסיים29, שומרים על הביטוי של גנים דפוס28,29, ושומרים על ה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לאינס מולהאן על שיבוט המבנים לתכנות מחדש, לפאולינה צ’לביק על ההפקה הוויראלית, ולמגדלנה גץ וג’ודית פישר-שטרניאק על הערות על כתב היד.
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
Referências
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
- Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).
- Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration – a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
- Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
- Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
- Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).
- Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
- Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).
- Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
- Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).
- Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
- Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).
- Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
- Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
- Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
- Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).
