여기서 우리는 출생 후 마우스의 중추 신경계의 다른 영역에서 유래 된 성상 세포의 고도로 농축 된 배양물을 생성하고 전사 인자의 강제 발현에 의해 기능적 뉴런으로 직접 전환시키는 상세한 프로토콜을 설명합니다.
직접 뉴런 재 프로그래밍은 다능성 중간체를 통과하지 않고 다른 스타터 세포 집단에서 기능적 뉴런을 생성하는 강력한 접근법입니다. 이 기술은 신경 퇴행성 질환을 앓고있는 환자의 섬유 아세포를 뉴런으로 전환 할 수 있기 때문에 질병 모델링 분야에서 큰 약속을 지닐뿐만 아니라 세포 기반 대체 요법에 대한 유망한 대안을 나타냅니다. 이러한 맥락에서, 주요한 과학적 돌파구는 성상세포와 같은 중추신경계 내에서 분화된 비신경세포가 시험관내에서 기능적 뉴런으로 전환될 수 있다는 것을 입증하는 것이었다. 그 이후로, 성상세포를 뉴런으로 시험관 내에서 직접 재프로그래밍하는 것은 강제 정체성 변환의 기초가 되는 분자 메커니즘과 효율적인 재프로그래밍을 방해하는 장애물에 대한 실질적인 통찰을 제공했다. 그러나, 상이한 실험실에서 수행된 시험관내 실험으로부터의 결과는 성상세포를 분리, 배양 및 재프로그래밍하는데 사용되는 방법의 차이로 인해 비교하기가 어렵다. 여기에서는 자기 세포 분류를 통해 출생 후 생쥐의 중추 신경계의 다른 영역에서 고순도의 성상 세포를 안정적으로 분리하고 배양하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 바이러스 형질도입 또는 DNA 형질감염을 통해 배양된 성상세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제공합니다. 이 간소화되고 표준화 된 프로토콜은 세포 동일성 유지의 기초가되는 분자 메커니즘, 새로운 신경 정체성의 확립, 특정 신경 아류형의 생성 및 그 기능적 특성을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.
포유동물 중추신경계(CNS)는 매우 복잡하며, 방대한 수의 상이한 뉴런 아형 1,2,3,4,5,6을 포함하는 수백 개의 상이한 세포 유형들로 구성된다. 다른 기관 또는 조직 7,8,9와는 달리, 포유동물 CNS는 매우 제한된 재생 능력을 갖는다; 외상성 뇌 손상 또는 신경 변성에 따른 신경 세포 손실은 돌이킬 수 없으며 종종 운동 및인지 결핍을 초래합니다10. 뇌 기능을 구하기 위해 잃어버린 뉴런을 대체하기위한 다양한 전략이 집중적 인 조사를 받고 있습니다11. 그 중에서도, 체세포를 기능적 뉴런으로 직접 재프로그래밍하는 것은 유망한 치료 접근법12로 부상하고 있다. 직접 재프로그래밍 또는 전분화는 하나의 분화된 세포 유형을 중간 증식성 또는 다능성 상태13,14,15,16을 거치지 않고 새로운 동일성으로 전환시키는 과정이다. 섬유아세포를 근육세포(17,18)로 전환시키기에 충분한 인자로서 MyoD1의 확인에 의해 개척된 이 방법은 여러 세포 유형을 기능적 뉴런(19,20,21)으로 재프로그래밍하는데 성공적으로 적용되었다.
CNS22,23에서 가장 풍부한 거대 아교세포 인 성상 세포는 여러 가지 이유로 직접 신경 재 프로그래밍을위한 특히 유망한 세포 유형입니다. 첫째, 그들은 CNS에 걸쳐 광범위하고 균등하게 분포되어 새로운 뉴런을위한 유전자좌 공급원이 풍부합니다. 둘째, 성상세포와 뉴런은 배아 발달 동안 공통조상인 방사상 신경교세포(24)를 공유하기 때문에 발달적으로 밀접한 관련이 있다. 두 세포 유형의 일반적인 배아 기원은 상이한 배아층19,21로부터의 세포의 재프로그래밍과 비교하여 뉴런 전환을 촉진하는 것으로 보인다. 더욱이, 그들의 방사상 신경교세포 기원을 통해 성상세포에 의해 유전된 패터닝 정보는 성인 성상세포(25,26,27)에서도 유지되며, 지역적으로 적절한 뉴런 아형(28,29,30)의 생성에 기여하는 것으로 보인다. 따라서 성상세포가 뉴런으로 전환되는 것을 조사하고 이해하는 것은 세포 기반 대체 전략에 대한이 기술의 잠재력을 최대한 발휘하는 데 중요한 부분입니다.
시험관내 배양된 성상세포를 뉴런으로 전환시키는 것은 다음을 포함하는 직접적인 뉴런 리프로그래밍 분야에서 몇 가지 돌파구를 가져왔다: i) 성상세포로부터 뉴런을 생성하기에 충분한 전사 인자의 확인15,19,31, ii) 동일한 세포 맥락에서 상이한 리프로그래밍 인자에 의해 촉발된 분자 메커니즘의 풀림(32) iii) 성상세포의 발달 기원이 상이한 뉴런 아류형을 유도하는 것에 미치는 영향을 강조한다28,29,33. 더욱이, 성상세포의 시험관내 직접 전환은 증가된 반응성 산소 종(ROS) 생산(34) 및 성상세포와 뉴런(35)의 미토콘드리아 프로테옴 사이의 차이와 같은 직접적인 뉴런 재프로그래밍(34,35)을 제한하는 몇 가지 주요 장애물을 풀었다. 따라서 이러한 관찰은 세포 정체성 유지, 세포 운명 변화를 막는 장애물 및 재 프로그래밍에서 신진 대사의 역할과 관련된 생물학12의 몇 가지 근본적인 질문을 조사하기 위해 직접 신경 재 프로그래밍을위한 모델로서 성상 세포의 일차 배양을 사용하는 것을 강력히지지합니다.
여기서 우리는 뮤린 척수29로부터 성상세포를 분리함으로써 입증된 바와 같이, 매우 높은 순도로 출생 후 (P) 나이에 마우스로부터 성상세포를 분리하기 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한 바이러스 형질도입 또는 DNA 플라스미드 형질감염을 통해 성상세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제공한다. 재프로그램된 세포는 형질도입 후 7일(7 DPT)에서 분석되어 리프로그래밍 효율 및 뉴런 형태학과 같은 다양한 측면을 평가하거나, 수주 동안 배양물에서 유지될 수 있고, 시간에 따른 성숙을 평가할 수 있다. 중요하게도, 이 프로토콜은 척수 성상세포에 특이적이지 않으며, 피질 회색 물질, 중뇌 및 소뇌를 포함한 다양한 다른 뇌 영역으로부터 성상세포를 분리하는데 용이하게 적용될 수 있다.
뮤린 성상세포의 일차 배양은 직접적인 뉴런 재프로그래밍을 연구하는 놀라운 시험관내 모델 시스템이다. 실제로, 출생 후 단계에서 단리되었음에도 불구하고, 세포는 전형적인 성상세포 마커(29)를 발현하고, 패터닝 유전자(28,29)의 발현을 유지하며,38세에 생체내 성상세포와 유사하게 증식하는 능력을 유지한다.<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
우리는 재 프로그래밍을위한 구조를 복제 한 Ines Mühlhahn, 바이러스 생산을위한 Paulina Chlebik, 원고에 대한 의견에 대한 Magdalena Götz와 Judith Fischer-Sternjak에게 감사드립니다.
0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
BDNF | Peprotech | 450-02 | |
bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
GDNF | Peprotech | 450-10 | |
gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
NT3 | Peprotech | 450-03 | |
octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |