Выделение и прямое нейрональное перепрограммирование астроцитов мыши
Summary
Здесь описан подробный протокол генерации высокообогащенных культур астроцитов, полученных из разных областей центральной нервной системы постнатальных мышей и их прямого преобразования в функциональные нейроны путем принудительной экспрессии факторов транскрипции.
Abstract
Прямое нейрональное перепрограммирование — это мощный подход к генерации функциональных нейронов из различных популяций стартовых клеток без прохождения через мультипотентные промежуточные продукты. Данная методика не только имеет большие перспективы в области моделирования заболеваний, так как позволяет преобразовывать, например, фибробласты пациентов, страдающих нейродегенеративными заболеваниями, в нейроны, но и представляет собой перспективную альтернативу клеточной заместительной терапии. В этом контексте крупным научным прорывом стала демонстрация того, что дифференцированные неневральные клетки в центральной нервной системе, такие как астроциты, могут быть преобразованы в функциональные нейроны in vitro. С тех пор прямое перепрограммирование астроцитов в нейроны in vitro дало существенное представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе принудительного преобразования идентичности, и препятствиях, которые препятствуют эффективному перепрограммированию. Однако результаты экспериментов in vitro, проведенных в разных лабораториях, трудно сравнивать из-за различий в методах, используемых для выделения, культивирования и перепрограммирования астроцитов. Здесь мы описываем подробный протокол надежного выделения и культивирования астроцитов с высокой чистотой из разных областей центральной нервной системы мышей в постнатальном возрасте с помощью магнитной сортировки клеток. Кроме того, мы предоставляем протоколы для перепрограммирования культивируемых астроцитов в нейроны посредством вирусной трансдукции или трансфекции ДНК. Этот оптимизированный и стандартизированный протокол может быть использован для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе поддержания идентичности клеток, установления новой нейронной идентичности, а также генерации конкретных подтипов нейронов и их функциональных свойств.
Introduction
Центральная нервная система млекопитающих (ЦНС) очень сложна, состоит из сотен различных типов клеток, включая огромное количество различных нейронных подтипов 1,2,3,4,5,6. В отличие от других органов или тканей 7,8,9, ЦНС млекопитающих обладает очень ограниченной регенеративной способностью; потеря нейронов после черепно-мозговой травмы или нейродегенерации необратима и часто приводит к двигательному и когнитивному дефициту10. Стремясь спасти функции мозга, различные стратегии по замене потерянных нейронов находятся под интенсивным исследованием11. Среди них прямое перепрограммирование соматических клеток в функциональные нейроны становится перспективным терапевтическим подходом12. Прямое перепрограммирование, или трансдифференцировка, представляет собой процесс преобразования одного дифференцированного типа клеток в новую идентичность без прохождения через промежуточное пролиферативное или плюрипотентное состояние 13,14,15,16. Впервые идентифицированный MyoD1 как фактора, достаточного для преобразования фибробластов в мышечные клетки17,18, этот метод был успешно применен для перепрограммирования нескольких типов клеток в функциональные нейроны 19,20,21.
Астроциты, наиболее распространенная макроглия в ЦНС22,23, являются особенно перспективным типом клеток для прямого нейронного перепрограммирования по нескольким причинам. Во-первых, они широко и равномерно распределены по всей ЦНС, обеспечивая обильный локо-источник для новых нейронов. Во-вторых, астроциты и нейроны тесно связаны между собой в развитии, так как у них общий предок во время эмбрионального развития, радиальные глиальные клетки24. Общее эмбриональное происхождение двух типов клеток, по-видимому, облегчает преобразование нейронов по сравнению с перепрограммированием клеток из разных зародышевых слоев19,21. Кроме того, информация о паттернах, унаследованная астроцитами через их радиальное происхождение глии, также поддерживается во взрослых астроцитах 25,26,27 и, по-видимому, способствует генерации регионально подходящих нейронных подтипов 28,29,30. Следовательно, исследование и понимание преобразования астроцитов в нейроны является важной частью достижения полного потенциала этой техники для клеточных стратегий замещения.
Превращение культивируемых in vitro астроцитов в нейроны привело к нескольким прорывам в области прямого нейронного перепрограммирования, в том числе: i) идентификация факторов транскрипции, достаточных для генерации нейронов из астроцитов 15,19,31, ii) разгадка молекулярных механизмов, вызванных различными факторами перепрограммирования в одном и том же клеточном контексте 32 и iii) подчеркивая влияние развития астроцитов на индуцирование различных нейронных подтипов 28,29,33. Кроме того, прямое преобразование астроцитов in vitro раскрыло несколько основных препятствий, которые ограничивают прямое нейрональное перепрограммирование34,35, таких как увеличение производства активных форм кислорода (АФК)34 и различия между митохондриальным протеомом астроцитов и нейронами35. Следовательно, эти наблюдения решительно поддерживают использование первичных культур астроцитов в качестве модели для прямого нейронного перепрограммирования для исследования нескольких фундаментальных вопросов в биологии12, связанных с поддержанием идентичности клеток, препятствиями, препятствующими изменениям судьбы клеток, а также ролью метаболизма в перепрограммировании.
Здесь мы представляем подробный протокол выделения астроцитов у мышей в постнатальном (P) возрасте с очень высокой чистотой, что продемонстрировано выделением астроцитов из мышиного спинного мозга29. Мы также предоставляем протоколы для перепрограммирования астроцитов в нейроны посредством вирусной трансдукции или трансфекции плазмид ДНК. Перепрограммированные клетки могут быть проанализированы через 7 дней после трансдукции (7 DPT) для оценки различных аспектов, таких как эффективность перепрограммирования и морфология нейронов, или могут поддерживаться в культуре в течение нескольких недель, чтобы оценить их созревание с течением времени. Важно отметить, что этот протокол не специфичен для астроцитов спинного мозга и может быть легко применен для выделения астроцитов из различных других областей мозга, включая серое вещество коры, средний мозг и мозжечок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Первичные культуры мышиных астроцитов представляют собой замечательную модельную систему in vitro для изучения прямого перепрограммирования нейронов. Фактически, несмотря на то, что они изолированы на постнатальной стадии, клетки экспрессируют типичные маркеры астроцитов<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Инес Мюльхан за клонирование конструкций для перепрограммирования, Паулину Хлебик за вирусное производство, а также Магдалену Гётц и Джудит Фишер-Штерняк за комментарии к рукописи.
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
Referências
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
- Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).
- Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration – a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
- Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
- Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
- Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).
- Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
- Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).
- Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
- Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).
- Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
- Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).
- Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
- Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
- Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
- Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).
