Aislamiento y reprogramación neuronal directa de astrocitos de ratón
Summary
Aquí describimos un protocolo detallado para generar cultivos altamente enriquecidos de astrocitos derivados de diferentes regiones del sistema nervioso central de ratones postnatales y su conversión directa en neuronas funcionales por la expresión forzada de factores de transcripción.
Abstract
La reprogramación neuronal directa es un enfoque poderoso para generar neuronas funcionales a partir de diferentes poblaciones de células iniciadoras sin pasar por intermedios multipotentes. Esta técnica no solo tiene grandes promesas en el campo del modelado de enfermedades, ya que permite convertir, por ejemplo, fibroblastos para pacientes que sufren enfermedades neurodegenerativas en neuronas, sino que también representa una alternativa prometedora para las terapias de reemplazo basadas en células. En este contexto, un gran avance científico fue la demostración de que las células no neurales diferenciadas dentro del sistema nervioso central, como los astrocitos, podrían convertirse en neuronas funcionales in vitro. Desde entonces, la reprogramación directa in vitro de astrocitos en neuronas ha proporcionado información sustancial sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la conversión forzada de identidad y los obstáculos que impiden una reprogramación eficiente. Sin embargo, los resultados de los experimentos in vitro realizados en diferentes laboratorios son difíciles de comparar debido a las diferencias en los métodos utilizados para aislar, cultivar y reprogramar astrocitos. Aquí, describimos un protocolo detallado para aislar y cultivar de manera confiable astrocitos con alta pureza de diferentes regiones del sistema nervioso central de ratones en edades postnatales a través de la clasificación de células magnéticas. Además, proporcionamos protocolos para reprogramar astrocitos cultivados en neuronas a través de la transducción viral o la transfección de ADN. Este protocolo simplificado y estandarizado se puede utilizar para investigar los mecanismos moleculares subyacentes al mantenimiento de la identidad celular, el establecimiento de una nueva identidad neuronal, así como la generación de subtipos neuronales específicos y sus propiedades funcionales.
Introduction
El sistema nervioso central (SNC) de los mamíferos es altamente complejo, que consta de cientos de tipos de células diferentes, incluyendo un gran número de diferentes subtipos neuronales 1,2,3,4,5,6. A diferencia de otros órganos o tejidos 7,8,9, el SNC de mamíferos tiene una capacidad regenerativa muy limitada; La pérdida neuronal después de una lesión cerebral traumática o neurodegeneración es irreversible y a menudo resulta en déficits motores y cognitivos10. Con el objetivo de rescatar las funciones cerebrales, diferentes estrategias para reemplazar las neuronas perdidas están bajo intensa investigación11. Entre ellos, la reprogramación directa de células somáticas en neuronas funcionales está emergiendo como un enfoque terapéutico prometedor12. La reprogramación directa, o transdiferenciación, es el proceso de convertir un tipo de célula diferenciada en una nueva identidad sin pasar por un estado proliferativo o pluripotente intermedio 13,14,15,16. Iniciado por la identificación de MyoD1 como un factor suficiente para convertir fibroblastos en células musculares17,18, este método se ha aplicado con éxito para reprogramar varios tipos de células en neuronas funcionales 19,20,21.
Los astrocitos, la macroglía más abundante en el SNC22,23, son un tipo de célula particularmente prometedor para la reprogramación neuronal directa por varias razones. En primer lugar, se distribuyen amplia y uniformemente en todo el SNC, proporcionando una fuente abundante en loco para nuevas neuronas. En segundo lugar, los astrocitos y las neuronas están estrechamente relacionados con el desarrollo, ya que comparten un ancestro común durante el desarrollo embrionario, las células gliales radiales24. El origen embrionario común de los dos tipos de células parece facilitar la conversión neuronal en comparación con la reprogramación de células de diferentes capas germinales19,21. Además, la información de patrones heredada por los astrocitos a través de su origen en la glía radial también se mantiene en los astrocitos adultos 25,26,27, y parece contribuir a la generación de subtipos neuronales regionalmente apropiados 28,29,30. Por lo tanto, investigar y comprender la conversión de astrocitos en neuronas es una parte importante para lograr todo el potencial de esta técnica para las estrategias de reemplazo basadas en células.
La conversión de astrocitos cultivados in vitro en neuronas ha dado lugar a varios avances en el campo de la reprogramación neuronal directa, entre ellos: i) la identificación de factores de transcripción suficientes para generar neuronas a partir de astrocitos 15,19,31, ii) el desentrañamiento de los mecanismos moleculares desencadenados por diferentes factores de reprogramación en el mismo contexto celular 32 , y iii) destacando el impacto del origen en el desarrollo de los astrocitos en la inducción de diferentes subtipos neuronales 28,29,33. Además, la conversión directa in vitro de astrocitos desentraña varios obstáculos importantes que limitan la reprogramación neuronal directa34,35, como el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS)34 y las diferencias entre el proteoma mitocondrial de los astrocitos y las neuronas35. Por lo tanto, estas observaciones apoyan firmemente el uso de cultivos primarios de astrocitos como modelo para la reprogramación neuronal directa para investigar varias preguntas fundamentales en biología12, relacionadas con el mantenimiento de la identidad celular, los obstáculos que previenen los cambios en el destino celular, así como el papel del metabolismo en la reprogramación.
Aquí presentamos un protocolo detallado para aislar astrocitos de ratones en edad postnatal (P) con muy alta pureza, como lo demuestra el aislamiento de astrocitos de la médula espinal murina29. También proporcionamos protocolos para reprogramar astrocitos en neuronas a través de la transducción viral o la transfección de plásmidos de ADN. Las células reprogramadas se pueden analizar a los 7 días después de la transducción (7 DPT) para evaluar diversos aspectos, como la eficiencia de reprogramación y la morfología neuronal, o se pueden mantener en cultivo durante varias semanas, para evaluar su maduración a lo largo del tiempo. Es importante destacar que este protocolo no es específico de los astrocitos de la médula espinal y se puede aplicar fácilmente para aislar astrocitos de varias otras regiones del cerebro, incluida la materia gris cortical, el mesencéfalo y el cerebelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los cultivos primarios de astrocitos murinos son un notable sistema modelo in vitro para estudiar la reprogramación neuronal directa. De hecho, a pesar de estar aisladas en una etapa postnatal, las células expresan marcadores típicos de astrocitos29, retienen la expresión de genes de patrones28,29 y mantienen la capacidad de proliferación, similar a los astrocitos in vivo a una edad comparablede 38<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Ines Mühlhahn por clonar los constructos para la reprogramación, a Paulina Chlebik por la producción viral y a Magdalena Götz y Judith Fischer-Sternjak por los comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
Referências
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