Isolering og direkte neuronal omprogrammering av mus astrocytter
Summary
Her beskriver vi en detaljert protokoll for å generere høyt berikede kulturer av astrocytter avledet fra forskjellige regioner i sentralnervesystemet hos postnatale mus og deres direkte konvertering til funksjonelle nevroner ved tvungen uttrykk for transkripsjonsfaktorer.
Abstract
Direkte neuronal omprogrammering er en kraftig tilnærming for å generere funksjonelle nevroner fra forskjellige startcellepopulasjoner uten å passere gjennom multipotente mellomprodukter. Denne teknikken har ikke bare store løfter innen sykdomsmodellering, da det gjør det mulig å konvertere for eksempel fibroblaster for pasienter som lider av nevrodegenerative sykdommer til nevroner, men representerer også et lovende alternativ for cellebaserte erstatningsterapier. I denne sammenheng var et stort vitenskapelig gjennombrudd demonstrasjonen av at differensierte ikke-nevrale celler i sentralnervesystemet, som astrocytter, kunne omdannes til funksjonelle nevroner in vitro. Siden da har in vitro direkte omprogrammering av astrocytter i nevroner gitt betydelig innsikt i de molekylære mekanismene som ligger til grunn for tvungen identitetskonvertering og hindringene som forhindrer effektiv omprogrammering. Resultater fra in vitro-eksperimenter utført i forskjellige laboratorier er imidlertid vanskelige å sammenligne på grunn av forskjeller i metodene som brukes til å isolere, dyrke og omprogrammere astrocytter. Her beskriver vi en detaljert protokoll for pålitelig å isolere og dyrke astrocytter med høy renhet fra forskjellige regioner i sentralnervesystemet hos mus i postnatal alder via magnetisk cellesortering. Videre gir vi protokoller for å omprogrammere dyrkede astrocytter til nevroner via viral transduksjon eller DNA-transfeksjon. Denne strømlinjeformede og standardiserte protokollen kan brukes til å undersøke de molekylære mekanismene som ligger til grunn for vedlikehold av celleidentitet, etablering av en ny nevronidentitet, samt generering av spesifikke nevronale subtyper og deres funksjonelle egenskaper.
Introduction
Pattedyrets sentralnervesystem (CNS) er svært komplekst, og består av hundrevis av forskjellige celletyper, inkludert et stort antall forskjellige nevronale subtyper 1,2,3,4,5,6. I motsetning til andre organer eller vev 7,8,9 har pattedyrets CNS en svært begrenset regenerativ kapasitet; nevrontap etter traumatisk hjerneskade eller nevrodegenerasjon er irreversibel og resulterer ofte i motoriske og kognitive underskudd10. Med sikte på å redde hjernefunksjoner, er forskjellige strategier for å erstatte tapte nevroner under intens undersøkelse11. Blant dem fremstår direkte omprogrammering av somatiske celler til funksjonelle nevroner som en lovende terapeutisk tilnærming12. Direkte omprogrammering, eller transdifferensiering, er prosessen med å konvertere en differensiert celletype til en ny identitet uten å passere gjennom en mellomliggende proliferativ eller pluripotent tilstand 13,14,15,16. Banebrytende ved identifisering av MyoD1 som en faktor som er tilstrekkelig til å konvertere fibroblaster til muskelceller17,18, har denne metoden blitt brukt til å omprogrammere flere celletyper til funksjonelle nevroner 19,20,21.
Astrocytter, den mest tallrike makroglia i CNS22,23, er en spesielt lovende celletype for direkte neuronal omprogrammering av flere grunner. For det første er de bredt og jevnt fordelt over CNS, noe som gir en rikelig i loco kilde for nye nevroner. For det andre er astrocytter og nevroner utviklingsmessig nært beslektet, da de deler en felles forfader under embryonal utvikling, de radiale gliacellene24. Den felles embryonale opprinnelsen til de to celletypene ser ut til å lette nevronkonvertering sammenlignet med omprogrammering av celler fra forskjellige kimlag19,21. Videre opprettholdes mønsterinformasjon arvet av astrocytter gjennom deres radiale glia-opprinnelse også i voksne astrocytter 25,26,27, og ser ut til å bidra til generering av regionalt passende nevronale subtyper 28,29,30. Derfor er undersøkelse og forståelse av konvertering av astrocytter til nevroner en viktig del av å oppnå det fulle potensialet i denne teknikken for cellebaserte erstatningsstrategier.
Omdannelsen av in vitro-dyrkede astrocytter til nevroner har ført til flere gjennombrudd innen direkte nevronal omprogrammering, inkludert: i) identifisering av transkripsjonsfaktorer som er tilstrekkelige til å generere nevroner fra astrocytter 15,19,31, ii) oppløsningen av molekylære mekanismer utløst av forskjellige omprogrammeringsfaktorer i samme cellulære kontekst 32 , og iii) fremheve virkningen av utviklingsopprinnelsen til astrocytter på å indusere forskjellige nevronale subtyper 28,29,33. Videre unravelled in vitro direkte konvertering av astrocytter flere store hindringer som begrenser direkte neuronal omprogrammering34,35, for eksempel økt reaktiv oksygenart (ROS) produksjon34 og forskjeller mellom mitokondriell proteom av astrocytter og nevroner35. Derfor støtter disse observasjonene sterkt bruken av primære kulturer av astrocytter som en modell for direkte neuronal omprogrammering for å undersøke flere grunnleggende spørsmål i biologi12, relatert til vedlikehold av celleidentitet, veisperringer som forhindrer celleskjebneendringer, samt metabolismens rolle i omprogrammering.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for å isolere astrocytter fra mus i postnatal (P) alder med svært høy renhet, som vist ved å isolere astrocytter fra murine ryggmargen29. Vi tilbyr også protokoller for å omprogrammere astrocytter til nevroner via viral transduksjon eller DNA-plasmidtransfeksjon. Omprogrammerte celler kan analyseres 7 dager etter transduksjon (7 DPT) for å vurdere ulike aspekter, for eksempel omprogrammeringseffektivitet og nevronmorfologi, eller kan opprettholdes i kultur i flere uker, for å vurdere modningen over tid. Det er viktig at denne protokollen ikke er spesifikk for ryggmargs astrocytter og kan lett brukes til å isolere astrocytter fra forskjellige andre hjernegrupper, inkludert kortikal grå substans, midthjerne og cerebellum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primære kulturer av murine astrocytter er et bemerkelsesverdig in vitro modellsystem for å studere direkte neuronal omprogrammering. Faktisk, til tross for at de er isolert på et postnatalstadium, uttrykker celler typiske astrocyttmarkører29, beholder uttrykket av mønstergener 28,29, og opprettholder kapasiteten til å spre seg, lik in vivo astrocytter i en sammenlignbar alder38. Etter MACS-me…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Ines Mühlhahn for kloning av konstruksjonene for omprogrammering, Paulina Chlebik for viral produksjon, og Magdalena Götz og Judith Fischer-Sternjak for kommentarer til manuskriptet.
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
Referências
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
- Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).
- Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration – a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
- Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
- Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
- Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).
- Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
- Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).
- Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
- Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).
- Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
- Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).
- Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
- Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
- Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
- Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).
