Organotypische retinale explantculturen van makaken
Summary
Netvliesexplantaten verkregen uit wilde makaken werden in vitro gekweekt. Retinale degeneratie en de cGMP-PKG signaleringsroute werd geïnduceerd met behulp van de PDE6-remmer zaprinast. cGMP-accumulatie in de explantaten bij verschillende zaprinastconcentraties werd geverifieerd met behulp van immunofluorescentie.
Abstract
Erfelijke retinale degeneratie (RD) wordt gekenmerkt door progressieve fotoreceptorceldood. Overactivatie van de cyclische guanosinemonofosfaat (cGMP)-afhankelijke proteïnekinase (PKG) route in fotoreceptorcellen veroorzaakt fotoreceptorceldood, vooral in modellen met fosfodiësterase 6b (PDE6b) mutaties. Eerdere studies over RD hebben voornamelijk muizenmodellen gebruikt, zoals rd1 – of rd10-muizen . Gezien de genetische en fysiologische verschillen tussen muizen en mensen, is het belangrijk om te begrijpen in hoeverre de netvliezen van primaten en knaagdieren vergelijkbaar zijn. Makaken delen een hoge mate van genetische gelijkenis met mensen. Daarom werden wild-type makaken (leeftijd 1-3 jaar) geselecteerd voor de in vitro cultuur van retinale explantaten die het retina-retinale pigmentepitheel (RPE)-choroidecomplex bevatten. Deze explants werden behandeld met verschillende concentraties van de PDE6-remmer zaprinast om de cGMP-PKG-signaleringsroute te induceren en RD-pathogenese te simuleren. cGMP-accumulatie en celdood in retinale explantaten van primaten werden vervolgens geverifieerd met behulp van immunofluorescentie en de TUNEL-test. Het retinale model van primaten dat in deze studie is vastgesteld, kan dienen voor relevante en effectieve studies naar de mechanismen van cGMP-PKG-afhankelijk RD, evenals voor de ontwikkeling van toekomstige behandelingsbenaderingen.
Introduction
Erfelijke retinale degeneratie (RD) wordt gekenmerkt door progressieve fotoreceptorceldood en wordt veroorzaakt door mutaties in een grote verscheidenheid aan pathogene genen1. Het eindresultaat van RD is verlies van het gezichtsvermogen en in de overgrote meerderheid van de gevallen blijft de ziekte tot op de dag van vandaag onbehandelbaar. Daarom is het belangrijk om de cellulaire mechanismen te bestuderen die leiden tot fotoreceptordood met behulp van modellen die de menselijke ziektetoestand getrouw weergeven. Hier zijn op primaten gebaseerde modellen van bijzonder belang vanwege hun nabijheid tot de mens. Met name kunnen dergelijke modellen de ontwikkeling bevorderen van geschikte therapeutische interventies die fotoreceptorceldood kunnen stoppen of vertragen.
Eerder onderzoek naar de mechanismen van celdood bij RD heeft aangetoond dat de afname of het verlies van fosfodiësterase 6 (PDE6) activiteit veroorzaakt door RD-triggerende genmutaties leidt tot verminderde hydrolyse van cyclisch guanosinemonofosfaat (cGMP)2,3. cGMP is een specifieke agonist van de cyclische nucleotide-gated ionkanalen (CNGCs) in de staafbuitensegmenten (ROSs) en is ook een sleutelmolecuul dat verantwoordelijk is voor de omzetting van lichtsignalen in elektrische signalen in gewervelde fotoreceptorcellen4. Verminderde cGMP-hydrolyse veroorzaakt de accumulatie van cGMP in ROSs, wat leidt tot de opening van CNGCs 5. Bijgevolg worden de fototransductieroutes geactiveerd, wat resulteert in een toename van kationconcentraties in fotoreceptorcellen. Dit proces legt een metabole belasting op fotoreceptoren, die bij overactivering, bijvoorbeeld door mutaties in PDE6, celdood kunnen veroorzaken.
Veel studies hebben aangetoond dat een significante overaccumulatie van cGMP in fotoreceptoren van muismodellen met verschillende RD-genmutaties de activering van cGMP-afhankelijk eiwitkinase (PKG)3,6 kan veroorzaken. Dit leidt tot een aanzienlijke toename van afstervende, TUNEL-positieve cellen en een geleidelijke verdunning van de fotoreceptorcellaag. Eerdere studies suggereren dat PKG-overactivatie veroorzaakt door verhoogde cGMP-niveaus een noodzakelijke en voldoende voorwaarde is voor de inductie van fotoreceptorceldood 2,5. Studies op verschillende muismodellen van RD hebben ook aangetoond dat PKG-activering geïnduceerd door verhoogde cGMP-niveaus in fotoreceptoren, leidt tot overactivatie van downstream-effectoren zoals poly-ADP-ribose polymerase 1 (PARP1), histon deacetylase (HDAC) en calpaïne 2,7,8,9. Dit impliceert causale associaties tussen deze verschillende doeleiwitten en fotoreceptorceldood.
Eerder onderzoek naar de pathologie, toxicofarmacologie en therapie van RD was echter voornamelijk gebaseerd op muismodellen voor RD10,11,12. Niettemin blijven er enorme moeilijkheden bestaan bij de klinische vertaling van deze resultaten. Dit komt door de aanzienlijke genetische en fysiologische verschillen tussen muizen en mensen, vooral met betrekking tot de netvliesstructuur. Daarentegen delen niet-menselijke primaten (NHP’s) ook een hoge mate van gelijkenis met mensen met betrekking tot genetische kenmerken, fysiologische patronen en regulatie van omgevingsfactoren. Zo werd optogenetische therapie onderzocht als middel om de retinale activiteit te herstellen in een NHP-model13. Lingam en collega’s toonden aan dat goede productiepraktijken van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide retinale fotoreceptorvoorlopercellen kegelfotoreceptorschade in NHP14 kunnen redden. Daarom zijn NHP-modellen belangrijk voor de verkenning van RD-pathogenese en de ontwikkeling van effectieve behandelmethoden. In het bijzonder zouden NHP-modellen van RD, die pathogene mechanismen vertonen die vergelijkbaar zijn met die bij mensen, een cruciale rol kunnen spelen in studies over de ontwikkeling en in vivo toxicofarmacologische analyse van nieuwe geneesmiddelen.
Gezien de lange levenscyclus, het hoge niveau van technische problemen en de hoge kosten die gemoeid zijn met het opzetten van in vivo primatenmodellen, hebben we een in vitro niet-menselijk primaat (NHP) model opgesteld met behulp van culturen van geëxplanteerde makaken netvlies. Eerst werden wild-type makaken van 1-3 jaar oud geselecteerd voor in vitro kweek van retinale explantaten, waaronder het retina-RPE-choroïde complex. Explants werden vervolgens behandeld met verschillende concentraties van de PDE6-remmer zaprinast (100 μM, 200 μM en 400 μM) om de cGMP-PKG-signaalroute te induceren. Fotoreceptorceldood werd gekwantificeerd en geanalyseerd met behulp van de TUNEL-test en cGMP-accumulatie in explantaten werd geverifieerd via immunofluorescentie. Gezien de hoge mate van gelijkenis met betrekking tot celverdeling en morfologie, dikte van de retinale laag en andere fysiologische kenmerken van het netvlies tussen apen en mensen, kan de vaststelling van de cGMP-PKG-signaleringsroute in het in vitro retinale model toekomstig onderzoek naar de pathogenese van RD vergemakkelijken, evenals studies naar de ontwikkeling en toxicofarmacologie van nieuwe geneesmiddelen voor RD-behandeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Visuele fototransductie verwijst naar het biologische proces waarbij lichtsignalen worden omgezet in elektrische signalen door fotoreceptorcellen in het netvlies van het oog. Fotoreceptorcellen zijn gepolariseerde neuronen die in staat zijn tot fototransductie en er zijn twee verschillende soorten fotoreceptoren die staven en kegeltjes worden genoemd naar de vormen van hun buitenste segmenten. Staafjes zijn verantwoordelijk voor het scotopische zicht en kegeltjes zijn verantwoordelijk voor fotopisch en hoog scherpte zich…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr. 81960180), de Zinke heritage foundation en de Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). We danken Prof. Longbao Lv (Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming, China) voor het delen van de apenoogballen die in deze studie zijn gebruikt.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
Referências
- O’Neal, T. B., Luther, E. E. . StatPearls. , (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration – Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
