Den nuværende protokol fremhæver anvendelsen af western blotting teknik til at studere funktioner og aktiviteter af neuronal K-Cl co-transporter KCC2. Protokollen beskriver undersøgelsen af KCC2-phosphorylering på kinaseregulerende steder Thr906/1007 via western blotting. Yderligere metoder til bekræftelse af KCC2-aktivitet er også kort fremhævet i denne tekst.
Kaliumchlorid cotransporters 2 (KCC2) er medlem af den opløste bærerfamilie 12 (SLC12) af kation-chlorid-cotransportere (CCC’er), der udelukkende findes i neuronen og er afgørende for, at Cl-homeostase fungerer korrekt og følgelig funktionel GABAergisk hæmning. Manglende korrekt regulering af KCC2 er skadelig og har været forbundet med forekomsten af flere neurologiske sygdomme, herunder epilepsi. Der er sket betydelige fremskridt med hensyn til at forstå de mekanismer, der er involveret i reguleringen af KCC2, akkrediteret til udvikling af teknikker, der gør det muligt for forskere at studere dets funktioner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering af kinaseregulerende steder phosphorylering) eller indirekte (observation og overvågning af GABA-aktivitet) undersøgelser. Her fremhæver protokollen, hvordan man undersøger KCC2-fosforylering på kinaseregulerende steder – Thr906 og Thr1007 – ved hjælp af western blotting-teknik. Der er andre klassiske metoder, der bruges til direkte at måle KCC2-aktivitet, såsom rubidiumion og thalliumionoptagelsesanalyse. Yderligere teknikker såsom patch-clamp-elektrofysiologi bruges til at måle GABA-aktivitet; derfor indirekte afspejler aktiveret og / eller inaktiveret KCC2 som informeret ved vurderingen af intracellulær chloridionhomeostase. Et par af disse yderligere teknikker vil kort blive diskuteret i dette manuskript.
Kaliumchlorid cotransporters 2 (KCC2) er medlem af den opløste bærerfamilie 12 (SLC12) af kation-chlorid-cotransportere (CCC’er), der udelukkende findes i neuronen og er afgørende for, at Cl-homeostase fungerer korrekt og følgelig funktionel GABAergisk hæmning 1,2,3,4. Vedligeholdelsen af lav intraneuronal Cl-koncentration ([Cl-]i) ved 4-6 mM ved KCC2 letter γ-aminosmørsyre (GABA)/glycinhyperpolarisering og synaptisk hæmning i hjernen og rygmarven5. Manglende korrekt regulering af KCC2 har været forbundet med forekomsten af flere neurologiske sygdomme, herunder epilepsi4. Desuden har nedsat KCC2-medieret Cl-ekstrudering og nedsat hyperpolariserende GABAA og / eller glycinreceptormedierede strømme været impliceret i epilepsi, neuropatisk smerte og spasticitet 6,7. Neuronal KCC2 moduleres negativt via phosphorylering af vigtige regulatoriske rester inden for dets C-terminale intracellulære domæne af det med-ingen-lysin (WNK)-STE20 / SPS1-relaterede prolin / alaninrige (SPAK) / Oxidativ stressresponsiv (OSR) kinasesignalkompleks1, hvilket letter vedligeholdelsen af depolariseret GABA-aktivitet i umodne neuroner 2,8,9 . WNK-SPAK / OSR1 phosphorylerer threoninrester 906 og 1007 (Thr906 / Thr1007) og nedregulerer efterfølgende mRNA-genekspression af KCC2, hvilket fører til en deraf følgende forringelse af dets fysiologiske funktion 8,10. Endnu vigtigere er det imidlertid allerede en kendsgerning, at WNK-SPAK / OSR1 kinasekomplekset er kendt for phosphorylat og hæmmer KCC2-ekspression 1,2,4,11,12, og at inhiberingen af kinasekompleksets signalveje til phosphorylat Thr906 / Thr1007 har været forbundet med den øgede ekspression af KCC2 mRNA-genet 13,14,15 . Det er vigtigt at bemærke, at reguleringen af neuronal KCC2 og Na+-K+-2Cl– cotransporters 1 (NKCC1) ekspression via proteinfosforylering virker samtidigt og i omvendte mønstre 1,4,16.
Der er sket konsekvente og betydelige fremskridt med hensyn til forståelsen af de mekanismer, der er involveret i reguleringen af KCC2, og som er akkrediteret til udvikling af teknikker, der gør det muligt for forskere at studere dets funktioner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering af kinaseregulerende steder phosphorylering) eller indirekte (observation og overvågning af GABA-aktivitet) undersøgelser. Protokollen, der præsenteres her, fremhæver anvendelsen af western blotting-teknikker til at studere funktionerne og aktiviteterne hos neuronal K +-Cl-co-transporter KCC2 ved at undersøge phosphorylering af cotransporteren på kinaseregulerende steder Thr906/1007.
Western blot er en metode, der bruges til at detektere specifikke proteiner af interesse fra en prøve af væv eller celle. Denne metode adskiller først proteinerne efter størrelse gennem elektroforese. Proteinerne overføres derefter elektroforetisk til en fast støtte (normalt en membran), før målproteinet markeres ved hjælp af et specifikt antistof. Antistofferne er konjugeret til forskellige tags eller fluorophorekonjugerede antistoffer, der detekteres ved hjælp af enten kolorimetriske, kemiluminescens eller fluorescensmetoder. Dette gør det muligt at detektere et specifikt målprotein fra en blanding af proteiner. Denne teknik er blevet brugt til at karakterisere fosfospecifikke steder i KCCs1 og er blevet brugt til at identificere kinasehæmmere, der hæmmer KCC3 Thr991 / Thr1048 phosphorylation17. Ved at følge denne protokol kan man specifikt detektere total og phosphoryleret KCC2 fra celle / væv lysater. I princippet er påvisning af proteinkonjugerede antistoffer ved hjælp af denne teknik meget instrumentel, da det hjælper med at forbedre forståelsen af samarbejdsaktiviteter på phospho-stederne i KCC2, hvilket kaster lys over de molekylære mekanismer, der er involveret i deres fysiologiske reguleringer. Den kvantitative analyse af det samlede proteinekspression er repræsentativt for KCC2’s funktion og aktivitet. Der er andre klassiske metoder, der bruges til direkte at måle KCC2-aktivitet, såsom rubidiumion og thalliumionoptagelsesanalyse. Yderligere teknikker såsom patch-clamp-elektrofysiologi bruges til at måle GABA-aktivitet; derfor indirekte afspejler aktiveret og / eller inaktiveret KCC2 som informeret ved vurderingen af intracellulær chloridionhomeostase.
Mange metoder er blevet brugt til at måle aktiviteterne i SLC12 af CCC’er, der udtrykkes i neuronerne, herunder KCC2. Mange af disse teknikker har vist sig at forbedre den videnskabelige viden om analysen af disse transportørers funktionelle relevans og deres strukturfunktionsmønstre i forskellige sygdomsrelaterede mutationer. Kritisk er der fordele og forbehold ved de forskellige metoder21. Protokollen forklaret ovenfor skitserede imidlertid, hvordan man vurderer KCC2-phosphorylering på kinas…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af The Royal Society UK (Grant no. IEC \ NSFC \ 201094) og et Commonwealth Ph.D. Scholarship.
40% acrylamide | Sigma-Aldrich | A2917 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
Ammonium Per Sulfate | Sigma-Aldrich | 248614 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
anti pSPAK | Dundee University | S670B | Used as primary antibody for western blotting |
anti-KCC2 | Dundee University | S700C | Used as primary antibody for western blotting |
anti-KCC2 pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | Used as primary antibody for western blotting |
anti-KCC2 pThr1007 | Dundee University | S961C | Used as primary antibody for western blotting |
anti-KCC2 pThr906 | Dundee University | S959C | Used as primary antibody for western blotting |
anti-mouse | Cell Signalling technology | 66002 | Used as secondary antibody for western blotting |
anti-NKCC1 | Dundee University | S841B | Used as primary antibody for western blotting |
anti-NKCC1 pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | Used as primary antibody for western blotting |
anti-rabbit | Cell Signalling technology | C29F4 | Used as secondary antibody for western blotting |
anti-sheep | abcam | ab6900 | Used as secondary antibody for western blotting |
anti-SPAK | Dundee University | S669D | Used as primary antibody for western blotting |
anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | Used as primary antibody for western blotting |
Benzamine | Merck UK | 135828 | Used as component of lysis buffer |
Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Used as component of loading buffer and lysis buffer |
Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | Used for lysate protein quantification |
Casting apparatus | Atto | WSE-1165W | Used to run SDS-page electrophoresis |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 | Used in lysate preparation |
Centrifuge | VWR | MicroStar 17R | Used for spinning samples |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Used for cell culture experiment |
Dried Skimmed Milk | Marvel | N/A | Used to make blocking buffer |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | Used for cell culture |
ECL reagent | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | Used to develop image for western blotting |
EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | Used as component of lysis buffer |
EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | Used as component of lysis buffer |
Electrophoresis Power Supply | BioRad | PowerPAC HC | To supply power to run SDS-page electrophoresis |
Ethanol | ThermoFisher | E/0650DF/17 | Used for preparing sterilized equipments and environment |
Fetal Bovine Serum - heat inactivated | Merck Life Sciences UK | F9665 | Used for cell culture |
Fumehood | Walker | A7277 | Used for cell culture |
Gel Blotting – Whatman | GE Healthcare | 10426981 | Used in western blotting to make transfer sandwich |
Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | Used to make buffers |
GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | Version 6.0 | Used for plotting graphs and analysing data for western blotting |
HCl | Acros Organics | 10647282 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
Heating block | Grant | QBT1 | Used to heat WB loading samples |
HEK293 cells | Merck UK | 12022001-1VL | Cell line for culture experiment |
ImageJ Software | Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA | ImageJ 1.53e | Used to measure band intensities from western blotting images |
Imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | Used to take western blotting images |
Incubator | LEEC | LEEC precision 190D | Used for cell culture |
Isopropanol | Honeywell | 24137 | Used in casting gel for electrophoresis |
L-glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Used for cell culture |
Lithium dodecyl sulfate (LDS) | Novex | NP0008 | Used as loading buffer for western blotting |
MEM Non-essential amino acid | Merck Life Sciences UK | M7145 | Used for cell culture |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | Used for preparing lysates for WB |
Microplate reader | BioRad | iMark | Used for lysate protein concentration readout |
Microsoft Powerpoint | Microsoft, USA | PowerPoint2016 | Used to edit western blotting images |
Molecular Weight Marker | BioRad | 1610373 | Used for western blotting |
N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific | 23030 | Used for cell culture experiment |
Nitrocellulose membrane | Fisher Scientific | 45004091 | Used for western blotting |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Used for cell culture |
pH Meter | Mettler Toledo | Seven compact s210 | Used to monitor pH of buffer solutions |
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used as component of lysis buffer |
Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for cell culture |
PKCδ pThr505 | Cell Signalling technology | 9374 | Used as primary antibody for western blotting |
Sepharose Protein G | Generon | PG50-00-0002 | Used for immunoprecipitation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used as component of wash buffer |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used to prepare TBS-T buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | Used as component of lysis buffer |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | Used for cell culture |
sodium-β-glycerophosphate | Merck UK | G9422 | Used as component of lysis buffer |
Staurosporine (from Streptomyces sp.) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | Used for cell culture experiment |
Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | Used as component of lysis buffer |
TEMED | Sigma-Aldrich | T7024 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | Used in western blotting to transfer protein on membrane |
Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used as component of lysis buffer |
Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | Used for cell culture |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | Used as make TBS-T buffer |
Vacuum pump | Charles Austen | Dymax 5 | Used for cell culture |
Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | Used in sample preparation |
Vortex mixer | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | Used of mixing resolved sample |
Water bath | Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | Used to incubate solutions |