Etude des fonctions et activités du co-transporteur neuronal K-CL KCC2 par transfert Western

Summary

Le présent protocole met en évidence l’application de la technique de transfert Western pour étudier les fonctions et les activités du cotransporteur neuronal K-Cl KCC2. Le protocole décrit l’étude de la phosphorylation de KCC2 sur les sites régulateurs de kinases Thr906/1007 par transfert Western. En outre, des méthodes supplémentaires pour confirmer l’activité de KCC2 sont brièvement mises en évidence dans ce texte.

Abstract

Les cotransporteurs de chlorure de potassium 2 (KCC2) font partie de la famille des porteurs de soluté 12 (SLC12) des cotransporteurs de chlorure cationique (CCC), présents exclusivement dans le neurone et sont essentiels au bon fonctionnement de l’homéostasie Cl^– et par conséquent à l’inhibition fonctionnelle du GABAergique. L’échec de la régulation correcte de KCC2 est délétère et a été associé à la prévalence de plusieurs maladies neurologiques, y compris l’épilepsie. Des progrès considérables ont été accomplis dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la réglementation du KCC2, accrédité pour le développement de techniques permettant aux chercheurs d’étudier ses fonctions et ses activités; soit par des enquêtes directes (évaluation de la phosphorylation des sites régulateurs kinases) ou indirectes (observation et surveillance de l’activité GABA). Ici, le protocole souligne comment étudier la phosphorylation de KCC2 sur les sites régulateurs de kinases – Thr906 et Thr1007 – en utilisant la technique de transfert western. Il existe d’autres méthodes classiques utilisées pour mesurer directement l’activité de KCC2, telles que le test d’absorption des ions rubidium et thallium. D’autres techniques telles que l’électrophysiologie patch-clamp-pince sont utilisées pour mesurer l’activité du GABA; par conséquent, reflétant indirectement KCC2 activé et / ou inactivé tel qu’informé par l’évaluation de l’homéostasie ionique chlorure intracellulaire. Quelques-unes de ces techniques supplémentaires seront brièvement discutées dans ce manuscrit.

Introduction

Le cotransporteur de chlorure de potassium 2 (KCC2) est un membre de la famille des porteurs de soluté 12 (SLC12) des cotransporteurs de chlorure de cations (CCC), présents exclusivement dans le neurone et est essentiel au bon fonctionnement de l’homéostasie Cl^– et par conséquent à l’inhibition GABAergique fonctionnelle 1,2,3,4. Le maintien d’une faible concentration intraneuronale de Cl- ([Cl-]_i) à ^4-6 mM par KCC2 facilite l’hyperpolarisation de l’acide γ-aminobutyrique (GABA)/glycine et l’inhibition synaptique dans le cerveau et la moelle épinière⁵. L’échec de la régulation correcte de KCC2 a été associé à la prévalence de plusieurs maladies neurologiques, y compris l’épilepsie⁴. De plus, une diminution de l’extrusion Cl⁻ médiée par KCC2 et une altération des courants hyperpolarisants médiés par le GABA_A et/ou les récepteurs de glycine ont été impliqués dans l’épilepsie, la douleur neuropathique et la spasticité ^6,7. Le KCC2 neuronal est modulé négativement par phosphorylation de résidus régulateurs clés dans son domaine intracellulaire C-terminal par le complexe de signalisation kinase proline/alanine-rich (SPAK)/sensible au stress oxydatif (OSR)^lié à la proline/SPS1 sans lysine (WNK)-STE20/SPS1, qui facilite le maintien de l’activité dépolarisée du GABA dans les neurones immatures ^2,8,9 . Le WNK-SPAK/OSR1 phosphoryle les résidus de thréonine 906 et 1007 (Thr906/Thr1007) et régule par la suite à la baisse l’expression du gène de l’ARNm de KCC2, entraînant une détérioration conséquente de sa fonction physiologique ^8,10. Plus important encore, cependant, il est déjà un fait que le complexe kinase WNK-SPAK/OSR1 est connu pour phosphoryler et inhiber l’expression de KCC2 1,2,4,11,12, et que l’inhibition des voies de signalisation du complexe kinase pour phosphoryler Thr906/Thr1007 a été liée à l’expression accrue du gène de l’ARNm KCC2 ^13,14,15 . Il est important de noter que la régulation de l’expression neuronale KCC2 et Na+-K⁺-2Cl^– cotransporteurs 1 (NKCC1) via la phosphorylation des protéines fonctionne de manière concomitante et inverse 1,4,16.

Des progrès constants et considérables ont été accomplis en ce qui concerne la compréhension des mécanismes impliqués dans la réglementation du KCC2, accrédités pour le développement de techniques permettant aux chercheurs d’étudier ses fonctions et ses activités; soit par des enquêtes directes (évaluation de la phosphorylation des sites régulateurs kinases) ou indirectes (observation et surveillance de l’activité GABA). Le protocole présenté ici met en évidence l’application des techniques de transfert Western pour étudier les fonctions et les activités du co-transporteur neuronal K⁺-Cl^– KCC2 en étudiant la phosphorylation du cotransporteur sur les sites régulateurs de kinases Thr906/1007.

Le transfert Western est une méthode utilisée pour détecter des protéines spécifiques d’intérêt à partir d’un échantillon de tissu ou de cellule. Cette méthode sépare d’abord les protéines par taille par électrophorèse. Les protéines sont ensuite transférées électrophoristiquement sur un support solide (généralement une membrane) avant que la protéine cible ne soit marquée à l’aide d’un anticorps spécifique. Les anticorps sont conjugués à différents marqueurs ou anticorps conjugués au fluorophore qui sont détectés à l’aide de méthodes colorimétriques, de chimiluminescence ou de fluorescence. Cela permet de détecter une protéine cible spécifique à partir d’un mélange de protéines. Cette technique a été utilisée pour caractériser les sites phosphospécifiques des KCC¹ et a été utilisée pour identifier les inhibiteurs de kinases qui inhibent la phosphorylation KCC3 Thr991/Thr1048¹⁷. En suivant ce protocole, on peut détecter spécifiquement KCC2 total et phosphorylé à partir de lysats cellulaires / tissulaires. En principe, la détection d’anticorps conjugués aux protéines par cette technique est très instrumentale car elle permet d’améliorer la compréhension des activités coopératives sur les sites phosphographiques de KCC2, ce qui met en lumière les mécanismes moléculaires impliqués dans leurs régulations physiologiques. L’analyse quantitative de l’expression totale des protéines est représentative de la fonction et de l’activité de KCC2. Il existe d’autres méthodes classiques utilisées pour mesurer directement l’activité de KCC2, telles que le test d’absorption des ions rubidium et thallium. D’autres techniques telles que l’électrophysiologie patch-clamp-pince sont utilisées pour mesurer l’activité du GABA; par conséquent, reflétant indirectement KCC2 activé et / ou inactivé tel qu’informé par l’évaluation de l’homéostasie ionique chlorure intracellulaire.

Protocol

REMARQUE : Le protocole décrit la méthode de transfert Western pour détecter des protéines d’intérêt spécifiques. 1. Culture cellulaire et transfection Réchauffer tous les réactifs dans le bain de billes (37 °C) avant la procédure de culture cellulaire. Préparer le milieu de culture, le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de L-glutamine de 2 mM, 100 fois plus d’acides aminés non essentiels, 100 mM…

Representative Results

Ici, le résultat représentatif présenté à la figure 1 a étudié l’impact de la staurosporine et de la NEM sur la phosphorylation médiée par WNK-SPAK/OSR1 de KCC2 et NKCC1 dans les lignées cellulaires HEK293 exprimant de manière stable KCC2b (HEKrnKCC2b)18 en utilisant la technique de transfert Western. Des détails complets sur les résultats représentatifs sont discutés dans Zhang et al.15. Semblable à NEM, l…

Discussion

De nombreuses méthodes ont été utilisées pour mesurer les activités de SLC12 des CCC qui sont exprimées dans les neurones, y compris KCC2. Bon nombre de ces techniques se sont avérées améliorer les connaissances scientifiques sur l’analyse de la pertinence fonctionnelle de ces transporteurs et de leurs schémas structure-fonction dans différentes mutations liées à la maladie. De manière critique, il y a des avantages et des mises en garde aux différentes méthodes²¹. Cependant, le …

Materials

40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Ammonium Per Sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse	Cell Signalling technology	66002	Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	Used as primary antibody for western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Used for lysate protein quantification
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge	Eppendorf	5804	Used in lysate preparation
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk	Marvel	N/A	Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Used for cell culture
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Used to develop image for western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Used as component of lysis buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated	Merck Life Sciences UK	F9665	Used for cell culture
Fumehood	Walker	A7277	Used for cell culture
Gel Blotting – Whatman	GE Healthcare	10426981	Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Used to make buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Heating block	Grant	QBT1	Used to heat WB loading samples
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA	ImageJ 1.53e	Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Used to take western blotting images
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	Used for cell culture
Isopropanol	Honeywell	24137	Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)	Novex	NP0008	Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid	Merck Life Sciences UK	M7145	Used for cell culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	Used for preparing lysates for WB
Microplate reader	BioRad	iMark	Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane	Fisher Scientific	45004091	Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Used for cell culture
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Used for cell culture
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Used for immunoprecipitation
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used as component of wash buffer
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L5750	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508	Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Used for cell culture experiment
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Used as component of lysis buffer
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution	Merck Life Sciences UK	T4049	Used for cell culture
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump	Charles Austen	Dymax 5	Used for cell culture
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	Used of mixing resolved sample
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Used to incubate solutions