Estudo das Funções e Atividades do Co-Transportador Neuronal K-Cl KCC2 Usando Western Blotting

Summary

O presente protocolo destaca a aplicação da técnica de western blotting para estudar as funções e atividades do co-transportador neuronal K-Cl KCC2. O protocolo descreve a investigação da fosforilação de KCC2 em sítios reguladores de quinase Thr906/1007 via western blotting. Além disso, métodos adicionais para confirmar a atividade do KCC2 são brevemente destacados neste texto.

Abstract

Os cotransportadores de cloreto de potássio 2 (KCC2) são um membro da família de transportadores de solutos 12 (SLC12) dos cotransportadores de cloreto de catião (CCCs), encontrados exclusivamente no neurônio e são essenciais para o bom funcionamento da ^{Cl-homeostase} e, consequentemente, da inibição funcional do GABAérgico. A falha na regulação adequada da KCC2 é deletéria e tem sido associada à prevalência de várias doenças neurológicas, incluindo epilepsia. Houve avanços consideráveis no que diz respeito à compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação do KCC2, credenciados ao desenvolvimento de técnicas que permitam aos pesquisadores estudar suas funções e atividades; por meio de investigações diretas (avaliando a fosforilação dos sítios reguladores da quinase) ou indiretas (observando e monitorando a atividade do GABA). Aqui, o protocolo destaca como investigar a fosforilação de KCC2 em locais reguladores de quinase – Thr906 e Thr1007 – usando a técnica de western blotting. Existem outros métodos clássicos usados para medir diretamente a atividade do KCC2, como o ensaio de absorção de íons rubídio e íons tálio. Outras técnicas, como patch-clamp-electrophysiology são usadas para medir a atividade GABA; portanto, refletindo indiretamente KCC2 ativado e/ou inativado, conforme informado pela avaliação da homeostase intracelular de íons cloreto. Algumas dessas técnicas adicionais serão brevemente discutidas neste manuscrito.

Introduction

Os cotransportadores de cloreto de potássio 2 (KCC2) são membros da família de transportadores de solutos 12 (SLC12) dos cotransportadores de cloreto de cátions (CCCs), encontrados exclusivamente no neurônio e são essenciais para o bom funcionamento da ^{Cl-homeostase} e, consequentemente, para a inibição funcional do GABAérgico 1,2,3,4. A manutenção da baixa concentração intraneuronal de Cl- ([Cl-]_i) a 4-6 mM pelo KCC2 facilita a hiperpolarização do ácido ^{γ-aminobutírico} (GABA)/glicina e a inibição sináptica no cérebro e na medula espinhal⁵. A falha na regulação adequada da KCC2 tem sido associada à prevalência de várias doenças neurológicas, incluindo a epilepsia⁴. Além disso, a diminuição da extrusão de Cl⁻ mediada por KCC2 e as correntes hiperpolarizantes hiperpolarizantes GABA_A e/ou mediadas pelo receptor de glicina têm sido implicadas na epilepsia, dor neuropática e espasticidade ^6,7. O KCC2 neuronal é modulado negativamente via fosforilação de resíduos reguladores chave dentro de seu domínio intracelular C-terminal pelo complexo^{de sinalização 1} da quinase com não-lisina (WNK)-STE20/SPS1-related proline/alanine-rich (SPAK)/Oxidative stress-responsive (OSR), o que facilita a manutenção da atividade despolarizada do GABA em neurônios imaturos 2,8,9 . O WNK-SPAK/OSR1 fosforila os resíduos de treonina 906 e 1007 (Thr906/Thr1007) e, posteriormente, regula negativamente a expressão gênica de RNAm do KCC2, levando a uma consequente deterioração de sua função fisiológica ^8,10. Mais importante, no entanto, já é um fato que o complexo quinase WNK-SPAK/OSR1 é conhecido por fosforilar e inibir a expressão de KCC2 1,2,4,11,12, e que a inibição das vias de sinalização do complexo quinase para o fosforilato Thr906/Thr1007 tem sido associada ao aumento da expressão do gene mRNA KCC2 ^13,14,15 . É importante ressaltar que a regulação da expressão neuronal de KCC2 e Na+-K⁺–^{2Cl-cotransportadores} 1 (NKCC1) via fosforilação proteica funciona concomitantemente e em padrões inversos 1,4,16.

Houve avanços consistentes e consideráveis no que diz respeito à compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação do KCC2, credenciados ao desenvolvimento de técnicas que permitam aos pesquisadores estudar suas funções e atividades; por meio de investigações diretas (avaliando a fosforilação dos sítios reguladores da quinase) ou indiretas (observando e monitorando a atividade do GABA). O protocolo aqui apresentado destaca a aplicação de técnicas de western blotting para estudar as funções e atividades do co-transportador neuronal K⁺-Cl^– KCC2, investigando a fosforilação do cotransportador em sítios reguladores de quinase Thr906/1007.

Western blot é um método usado para detectar proteínas específicas de interesse de uma amostra de tecido ou célula. Este método primeiro separa as proteínas por tamanho através de eletroforese. As proteínas são então transferidas eletroforeticamente para um suporte sólido (geralmente uma membrana) antes que a proteína-alvo seja marcada usando um anticorpo específico. Os anticorpos são conjugados a diferentes tags ou anticorpos conjugados com fluoróforos que são detectados usando métodos colorimétricos, quimioluminescência ou fluorescência. Isso permite que uma proteína-alvo específica seja detectada a partir de uma mistura de proteínas. Essa técnica tem sido utilizada para caracterizar sítios fosfoespecíficos de KCCs¹ e tem sido utilizada para identificar inibidores de quinase que inibem a fosforilação de KCC3 Thr991/Thr1048¹⁷. Seguindo este protocolo, pode-se detectar especificamente KCC2 total e fosforilado a partir de lisatos celulares / teciduais. Em princípio, a detecção de anticorpos conjugados com proteínas por esta técnica é altamente instrumental, pois ajuda a melhorar a compreensão das atividades cooperativas nos fosfo-locais do KCC2, o que lança luz sobre os mecanismos moleculares envolvidos em suas regulações fisiológicas. A análise quantitativa da expressão proteica total é representativa da função e atividade do KCC2. Existem outros métodos clássicos usados para medir diretamente a atividade do KCC2, como o ensaio de absorção de íons rubídio e íons tálio. Outras técnicas, como patch-clamp-electrophysiology são usadas para medir a atividade GABA; portanto, refletindo indiretamente KCC2 ativado e/ou inativado, conforme informado pela avaliação da homeostase intracelular de íons cloreto.

Protocol

NOTA: O protocolo descreve o método de western blotting para detectar proteínas específicas de interesse. 1. Cultura celular e transfecção Aquecer todos os reagentes no banho de grânulos (37 °C) antes do procedimento de cultura celular. Preparar o meio de cultura, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% cada de 2mM de L-glutamina, 100x aminoácido não essencial, piruvato de sódio 100 mM e 100 unidades/mL de peni…

Representative Results

Aqui, o resultado representativo apresentado na Figura 1 investigou o impacto da estaurosporina e do NEM na fosforilação mediada por WNK-SPAK/OSR1 de KCC2 e NKCC1 em linhagens celulares de HEK293 expressando de forma estável KCC2b (HEKrnKCC2b)18 utilizando a técnica de western blotting. Detalhes abrangentes sobre os resultados representativos são discutidos em Zhang et al.15. Semelhante ao NEM, a estaurosporina é um in…

Discussion

Muitos métodos têm sido utilizados para medir as atividades do SLC12 de CCCs que são expressos nos neurônios, incluindo o KCC2. Muitas dessas técnicas provaram aprimorar o conhecimento científico sobre a análise da relevância funcional desses transportadores e seus padrões de estrutura-função em diferentes mutações relacionadas à doença. Criticamente, há vantagens e ressalvas para os vários métodos²¹. No entanto, o protocolo explicado acima, delineou como avaliar a fosforilação…

Materials

40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Ammonium Per Sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse	Cell Signalling technology	66002	Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	Used as primary antibody for western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Used for lysate protein quantification
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge	Eppendorf	5804	Used in lysate preparation
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk	Marvel	N/A	Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Used for cell culture
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Used to develop image for western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Used as component of lysis buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated	Merck Life Sciences UK	F9665	Used for cell culture
Fumehood	Walker	A7277	Used for cell culture
Gel Blotting – Whatman	GE Healthcare	10426981	Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Used to make buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Heating block	Grant	QBT1	Used to heat WB loading samples
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA	ImageJ 1.53e	Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Used to take western blotting images
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	Used for cell culture
Isopropanol	Honeywell	24137	Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)	Novex	NP0008	Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid	Merck Life Sciences UK	M7145	Used for cell culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	Used for preparing lysates for WB
Microplate reader	BioRad	iMark	Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane	Fisher Scientific	45004091	Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Used for cell culture
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Used for cell culture
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Used for immunoprecipitation
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used as component of wash buffer
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L5750	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508	Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Used for cell culture experiment
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Used as component of lysis buffer
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution	Merck Life Sciences UK	T4049	Used for cell culture
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump	Charles Austen	Dymax 5	Used for cell culture
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	Used of mixing resolved sample
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Used to incubate solutions