JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Исследование функций и активности нейронального K-Cl котранспортера KCC2 с использованием вестерн-блоттинга

Published: December 09, 2022
doi:
10.3791/64179
, , ,
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences,University of Exeter, Hatherly Laboratories

Summary

В настоящем протоколе подчеркивается применение метода западного блоттинга для изучения функций и активности нейронального K-Cl сотранспортера KCC2. Протокол описывает исследование фосфорилирования KCC2 на регуляторных участках киназы Thr906/1007 посредством западного блоттинга. Кроме того, в этом тексте кратко освещаются дополнительные методы подтверждения активности KCC2.

Abstract

Котранспортеры хлорида калия 2 (KCC2) являются членом семейства растворенных носителей 12 (SLC12) катион-хлорид-котранспортеров (CCC), обнаруженных исключительно в нейроне и необходимых для правильного функционирования Cl-гомеостаза и, следовательно, функционального ГАМКергического ингибирования. Неспособность в надлежащей регуляции KCC2 вредна и связана с распространенностью нескольких неврологических заболеваний, включая эпилепсию. Был достигнут значительный прогресс в понимании механизмов, участвующих в регулировании KCC2, аккредитованных для разработки методов, которые позволяют исследователям изучать его функции и деятельность; либо путем прямых (оценка фосфорилирования киназных регуляторных участков), либо косвенных (наблюдение и мониторинг активности ГАМК) исследований. Здесь протокол подчеркивает, как исследовать фосфорилирование KCC2 в регуляторных участках киназы – Thr906 и Thr1007 – с использованием метода западного блоттинга. Существуют и другие классические методы, используемые для непосредственного измерения активности KCC2, такие как анализ поглощения ионов рубидия и таллия. Для измерения активности ГАМК используются другие методы, такие как электрофизиология пластыря-зажима; следовательно, косвенно отражая активированный и/или инактивированный KCC2, полученный в результате оценки внутриклеточного хлорид-ионного гомеостаза. Некоторые из этих дополнительных методов будут кратко рассмотрены в этой рукописи.

Introduction

Котранспортеры хлорида калия 2 (KCC2) являются членом семейства растворенных носителей 12 (SLC12) катион-хлорид-котранспортеров (CCC), обнаруженных исключительно в нейроне и необходимых для правильного функционирования Cl-гомеостаза и, следовательно, функционального ГАМКергического ингибирования 1,2,3,4. Поддержание низкой внутринейрональной концентрации Cl– ([Cl–]i) при 4-6 мМ KCC2 способствует гиперполяризации γ-аминомасляной кислоты (ГАМК)/глицина и синаптическому ингибированию в головном и спинном мозге5. Сбой в правильной регуляции KCC2 был связан с распространенностью нескольких неврологических заболеваний, включая эпилепсию4. Кроме того, снижение KCC2-опосредованной Cl−экструзии и нарушение гиперполяризующих токов ГАМКА и/или глициновых рецепторов были вовлечены в эпилепсию, невропатическую боль и спастичность 6,7. Нейрональный KCC2 отрицательно модулируется путем фосфорилирования ключевых регуляторных остатков в его С-концевом внутриклеточном домене с помощью сигнального комплекса1, связанного с пролином/богатым аланином (SPAK)/окислительным стрессом (OSR), который облегчает поддержание деполяризованной активности ГАМК в незрелых нейронах 2,8,9 . WNK-SPAK/OSR1 фосфорилирует остатки треонина 906 и 1007 (Thr906/Thr1007) и впоследствии понижает экспрессию гена мРНК KCC2, что приводит к последующему ухудшению его физиологической функции 8,10. Что еще более важно, однако, уже фактом является то, что киназный комплекс WNK-SPAK/OSR1, как известно, фосфорилирует и ингибирует экспрессию KCC2 1,2,4,11,12, и что ингибирование сигнальных путей комплекса киназы к фосфорилату Thr906/Thr1007 было связано с повышенной экспрессией гена мРНК KCC2 13,14,15 . Важно отметить, что регуляция экспрессии нейронных KCC2 и Na+-K+-2Cl-котранспортеров 1 (NKCC1) посредством фосфорилирования белка работает одновременно и в обратных паттернах 1,4,16.

Был достигнут последовательный и значительный прогресс в отношении понимания механизмов, участвующих в регулировании KCC2, аккредитованных для разработки методов, которые позволяют исследователям изучать его функции и деятельность; либо путем прямых (оценка фосфорилирования киназных регуляторных участков), либо косвенных (наблюдение и мониторинг активности ГАМК) исследований. Протокол, представленный здесь, подчеркивает применение методов западного блоттинга для изучения функций и активности нейронального K+–Cl-ко-транспортера KCC2 путем исследования фосфорилирования котранспортера в регуляторных участках киназы Thr906/1007.

Вестерн-блот — это метод, используемый для обнаружения специфических белков, представляющих интерес, из образца ткани или клетки. Этот метод сначала разделяет белки по размеру с помощью электрофореза. Затем белки электрофоретически переносятся на твердую опору (обычно мембрану), прежде чем целевой белок будет помечен с использованием специфического антитела. Антитела конъюгируются с различными метками или флуорофорно-конъюгированными антителами, которые обнаруживаются с использованием колориметрического, хемилюминесцентного или флуоресцентного методов. Это позволяет обнаружить конкретный белок-мишень из смеси белков. Этот метод был использован для характеристики фосфосфоспецифических участков KCCs1 и был использован для идентификации ингибиторов киназы, которые ингибируют фосфорилирование KCC3 Thr991/Thr104817. Следуя этому протоколу, можно специфически обнаружить тотальный и фосфорилированный KCC2 из лизатов клеток / тканей. В принципе, обнаружение белково-конъюгированных антител с помощью этого метода является очень полезным, поскольку оно помогает улучшить понимание совместной деятельности на фосфо-сайтах KCC2, что проливает свет на молекулярные механизмы, участвующие в их физиологических нормах. Количественный анализ экспрессии общего белка репрезентативен для функции и активности KCC2. Существуют и другие классические методы, используемые для непосредственного измерения активности KCC2, такие как анализ поглощения ионов рубидия и таллия. Для измерения активности ГАМК используются другие методы, такие как электрофизиология пластыря-зажима; следовательно, косвенно отражая активированный и/или инактивированный KCC2, полученный в результате оценки внутриклеточного хлорид-ионного гомеостаза.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол описывает метод вестерн-блоттинга для обнаружения специфических белков, представляющих интерес. 1. Клеточная культура и трансфекция Разогрейте все реагенты в бисерной ванне (37 °C) перед процедурой культивирования клеток. Приготовьте к…

Representative Results

Здесь репрезентативный результат, представленный на рисунке 1, исследовал влияние ставроспорина и NEM на опосредованное WNK-SPAK/OSR1 фосфорилирование KCC2 и NKCC1 в клеточных линиях HEK293, стабильно экспрессирующих KCC2b (HEKrnKCC2b)18 с использованием метода западн…

Discussion

Многие методы были использованы для измерения активности SLC12 CCC, которые экспрессируются в нейронах, включая KCC2. Многие из этих методов доказали, что расширяют научные знания по анализу функциональной значимости этих транспортеров и их структурно-функциональных паттернов в различных ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Королевским обществом Великобритании (грант No IEC\NSFC\201094) и стипендией Содружества Ph.D. Scholarship.

Materials

40% acrylamide Sigma-Aldrich A2917 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per Sulfate Sigma-Aldrich 248614 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAK Dundee University S670B Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 Dundee University S700C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940 Thermo Fisher Scientific PA5-95678 Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007 Dundee University S961C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906 Dundee University S959C Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse Cell Signalling technology 66002 Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1 Dundee University S841B Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212 Dundee University S763B Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit Cell Signalling technology C29F4 Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep abcam ab6900 Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK Dundee University S669D Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III Sigma-Aldrich T8578 Used as primary antibody for western blotting
Benzamine Merck UK 135828 Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie Thermo Scientific 1856209 Used for lysate protein quantification
Casting apparatus Atto  WSE-1165W Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge Eppendorf 5804 Used in lysate preparation
Centrifuge VWR MicroStar 17R Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk Marvel N/A Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose Sigma-Aldrich D6429 Used for cell culture
ECL reagent Perkin Elmer ORTT755/2655 Used to develop image for western blotting
EDTA Fisher Scientific D/0700/53 Used as component of lysis buffer
EGTA Sigma-Aldrich e4378 Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply BioRad PowerPAC HC To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol ThermoFisher E/0650DF/17 Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated Merck Life Sciences UK F9665 Used for cell culture
Fumehood Walker A7277 Used for cell culture
Gel Blotting – Whatman GE Healthcare  10426981 Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine Sigma-Aldrich 15527 Used to make buffers
GraphPad Prism Software GraphPad Software, Inc., USA Version 6.0 Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl Acros Organics 10647282 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating block Grant QBT1 Used to heat WB loading samples
HEK293 cells Merck UK 12022001-1VL Cell line for culture experiment
ImageJ Software Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA  ImageJ 1.53e Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system BioRad ChemiDoc MP Used to take western blotting images
Incubator LEEC LEEC precision 190D Used for cell culture
Isopropanol Honeywell 24137 Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution Sigma-Aldrich G7513 Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS) Novex NP0008 Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid  Merck Life Sciences UK M7145 Used for cell culture
Microcentrifuge Eppendorf 5418 Used for preparing lysates for WB
Microplate reader BioRad iMark Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint Microsoft, USA PowerPoint2016 Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker BioRad 1610373 Used for western blotting
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific 23030 Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane Fisher Scientific 45004091 Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Used for cell culture
pH Meter Mettler Toledo Seven compact s210 Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline Sigma-Aldrich D8537 Used for cell culture
PKCδ pThr505 Cell Signalling technology 9374 Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G Generon PG50-00-0002 Used for immunoprecipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Used as component of wash buffer
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L5750 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich S8636 Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate Merck UK G9422 Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.) Scientific Laboratory Supplies, UK S4400-1MG Used for cell culture experiment
Sucrose Scientifc Laboratory Supplies S0389 Used as component of lysis buffer
TEMED Sigma-Aldrich T7024 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer Chamber BioRad 1658005EDU Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris Sigma-Aldrich T6066 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution Merck Life Sciences UK T4049 Used for cell culture
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179 Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump Charles Austen Dymax 5 Used for cell culture
Vortex Scientific Industries K-550-GE Used in sample preparation
Vortex mixer Scientific Industries Ltd Vortex-Genie  K-550-GE Used of mixing resolved sample
Water bath Grant Instruments Ltd. (JB Academy) JBA5 Used to incubate solutions
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
  2. Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
  3. Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
  4. Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
  5. Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
  6. Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
  7. Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington’s Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
  8. Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
  9. Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  10. Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
  11. Lu, D. C. -. Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
  12. Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
  13. AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
  15. Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
  16. Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
  18. Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
  19. Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  20. Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
  21. Medina, I., Pisella, L. I. . Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , 21-41 (2020).
  22. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  23. Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
  24. Lee, Y. -. C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
  25. Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
  26. Johansen, K., Svensson, L. . Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 15-28 (1998).
  27. Mahmood, T., Yang, P. -. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
  28. Klein, J. D., O’Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
  29. Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
  30. Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
  31. Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
  32. Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
  33. Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
  34. Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
  35. Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
  36. Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
  37. Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
  38. Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
  39. Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
  40. Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
  41. Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
  42. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user’s guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
  43. Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
  44. Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
  45. Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).

Tags

AI WriterAI Writing AssistantAI-generated ContentNatural Language ProcessingText GenerationContent AutomationAI-powered Copywriting
check_url/pt/64179?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F., Oguro-Ando, A., Zhang, J. Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting. J. Vis. Exp. (190), e64179, doi:10.3791/64179 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image