Studie av funktioner och aktiviteter av neuronala K-Cl Co-Transporter KCC2 med hjälp av Western Blotting

Summary

Detta protokoll belyser tillämpningen av western blotting-teknik för att studera funktioner och aktiviteter hos neuronal K-Cl-co-transporter KCC2. Protokollet beskriver undersökningen av KCC2-fosforylering vid kinasregleringsställen Thr906/1007 via western blotting. Dessutom markeras ytterligare metoder för att bekräfta KCC2-aktivitet kort i den här texten.

Abstract

Kaliumkloridkotransporterer 2 (KCC2) är en medlem av den lösta bärarfamiljen 12 (SLC12) av katjonklorid-cotransporters (CCC), som uteslutande finns i neuronen och är avgörande för att ^Cl-homeostas ska fungera korrekt och följaktligen funktionell GABAergisk hämning. Misslyckande med korrekt reglering av KCC2 är skadligt och har associerats med förekomsten av flera neurologiska sjukdomar, inklusive epilepsi. Det har gjorts betydande framsteg när det gäller att förstå de mekanismer som är involverade i regleringen av KCC2, ackrediterade för utveckling av tekniker som gör det möjligt för forskare att studera dess funktioner och aktiviteter. antingen via direkta (bedömning av kinasreglerande platser fosforylering) eller indirekta (observera och övervaka GABA-aktivitet) undersökningar. Här belyser protokollet hur man undersöker KCC2-fosforylering vid kinasregleringsställen – Thr906 och Thr1007 – med hjälp av western blotting-teknik. Det finns andra klassiska metoder som används för att direkt mäta KCC2-aktivitet, såsom rubidiumjon och talliumjonupptagsanalys. Ytterligare tekniker såsom patch-clamp-electrophysiology används för att mäta GABA-aktivitet; därför indirekt reflekterande aktiverad och/eller inaktiverad KCC2 som informerats av bedömningen av intracellulär kloridjonhomeostas. Några av dessa ytterligare tekniker kommer att diskuteras kort i detta manuskript.

Introduction

Kaliumkloridkotransporterer 2 (KCC2) är en medlem av den lösta bärarfamiljen 12 (SLC12) av katjonklorid-cotransporters (CCC), som uteslutande finns i neuronen och är avgörande för att ^Cl-homeostas ska fungera korrekt och följaktligen funktionell GABAergisk hämning 1,2,3,4. Upprätthållandet av låg intraneuronal Cl- koncentration ([Cl-]i) vid 4-6 mM av KCC2 underlättar ^{γ-aminosmörsyra} (GABA)/glycinhyperpolarisering och synaptisk hämning i hjärnan och ryggmärgen⁵. Misslyckande i korrekt reglering av KCC2 har associerats med förekomsten av flera neurologiska sjukdomar, inklusive epilepsi⁴. Dessutom har minskad KCC2-medierad Cl⁻-extrudering och nedsatt hyperpolariserande GABA_A– och/eller glycinreceptormedierade strömmar varit inblandade i epilepsi, neuropatisk smärta och spasticitet ^6,7. Neuronal KCC2 moduleras negativt via fosforylering av viktiga regulatoriska rester inom dess C-terminala intracellulära domän av med-ingen-lysin (WNK) -STE20 / SPS1-relaterad prolin / alaninrik (SPAK) / Oxidativ stressresponsiv (OSR) kinassignalkomplex¹, vilket underlättar upprätthållandet av depolariserad GABA-aktivitet i omogna neuroner ^2,8,9 . WNK-SPAK/OSR1-fosforylerar treoninrester 906 och 1007 (Thr906/Thr1007) och nedreglerar därefter mRNA-genuttrycket av KCC2, vilket leder till en därav följande försämring av dess fysiologiska funktion ^8,10. Ännu viktigare är dock att det redan är ett faktum att WNK-SPAK / OSR1-kinaskomplexet är känt för att fosforylera och hämma KCC2-uttryck 1,2,4,11,12, och att hämningen av kinaskomplexets signalvägar till fosforylat Thr906 / Thr1007 har kopplats till det ökade uttrycket av KCC2 mRNA-genen^13,14,15 . Det är viktigt att notera att regleringen av neuronala KCC2- och Na+-K⁺-2Cl^– cotransporters 1 (NKCC1) uttryck via proteinfosforylering fungerar samtidigt och i omvända mönster 1,4,16.

Det har gjorts konsekventa och betydande framsteg när det gäller förståelsen av mekanismer som är involverade i regleringen av KCC2, ackrediterade för utveckling av tekniker som gör det möjligt för forskare att studera dess funktioner och aktiviteter. antingen via direkta (bedömning av kinasreglerande platser fosforylering) eller indirekta (observera och övervaka GABA-aktivitet) undersökningar. Protokollet som presenteras här belyser tillämpningen av västerländska blottningstekniker för att studera funktionerna och aktiviteterna hos neuronal K ⁺-Cl^– co-transporter KCC2 genom att undersöka fosforyleringen av cotransporter vid kinasregleringsställen Thr906/1007.

Western blot är en metod som används för att detektera specifika proteiner av intresse från ett prov av vävnad eller cell. Denna metod separerar först proteinerna efter storlek genom elektrofores. Proteinerna överförs sedan elektroforetiskt till ett fast stöd (vanligtvis ett membran) innan målproteinet markeras med hjälp av en specifik antikropp. Antikropparna konjugeras till olika taggar eller fluoroforkonjugerade antikroppar som detekteras med antingen kolorimetriska, kemiluminescens eller fluorescensmetoder. Detta gör det möjligt att detektera ett specifikt målprotein från en blandning av proteiner. Denna teknik har använts för att karakterisera fosfospecifika ställen för KCCs¹ och har använts för att identifiera kinashämmare som hämmar KCC3 Thr991/Thr1048 fosforylering¹⁷. Genom att följa detta protokoll kan man specifikt detektera total och fosforylerad KCC2 från cell/ vävnadslysater. I princip är detektionen av proteinkonjugerade antikroppar med denna teknik mycket instrumentell eftersom den bidrar till att förbättra förståelsen för samarbetsaktiviteter vid fosfo-platserna i KCC2, vilket belyser de molekylära mekanismerna som är involverade i deras fysiologiska regler. Den kvantitativa analysen av det totala proteinuttrycket är representativ för KCC2: s funktion och aktivitet. Det finns andra klassiska metoder som används för att direkt mäta KCC2-aktivitet, såsom rubidiumjon och talliumjonupptagsanalys. Ytterligare tekniker såsom patch-clamp-electrophysiology används för att mäta GABA-aktivitet; därför indirekt reflekterande aktiverad och/eller inaktiverad KCC2 som informerats av bedömningen av intracellulär kloridjonhomeostas.

Protocol

OBS: Protokollet beskriver den västra blottningsmetoden för att detektera specifika proteiner av intresse. 1. Cellodling och transfektion Värm alla reagenser i pärlbadet (37 °C) före cellodlingsproceduren. Förbered odlingsmedium, Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM), kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 1% vardera av 2mM L-glutamin, 100x icke-essentiell aminosyra, 100 mM natriumpyruvat och 100 enheter / ml penicillin-streptomycin. Tina stab…

Representative Results

Här undersökte det representativa resultatet som presenteras i figur 1 effekten av staurosporin och NEM på WNK-SPAK / OSR1-medierad fosforylering av KCC2 och NKCC1 i HEK293-cellinjer som stabilt uttrycker KCC2b (HEKrnKCC2b)18 med hjälp av western blotting-tekniken. Omfattande detaljer om de representativa resultaten diskuteras i Zhang et al.15. I likhet med NEM är staurosporin en bred kinashämmare som kan förbättra K…

Discussion

Många metoder har använts för att mäta aktiviteterna hos SLC12 av CCC som uttrycks i neuronerna, inklusive KCC2. Många av dessa tekniker har visat sig öka den vetenskapliga kunskapen om analysen av dessa transportörers funktionella relevans och deras struktur-funktionsmönster i olika sjukdomsrelaterade mutationer. Kritiskt finns det fördelar och förbehåll för de olika metoderna²¹. Protokollet som förklaras ovan beskrev dock hur man bedömer KCC2-fosforylering vid kinasregleringsställ…

Materials

40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Ammonium Per Sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse	Cell Signalling technology	66002	Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	Used as primary antibody for western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Used for lysate protein quantification
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge	Eppendorf	5804	Used in lysate preparation
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk	Marvel	N/A	Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Used for cell culture
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Used to develop image for western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Used as component of lysis buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated	Merck Life Sciences UK	F9665	Used for cell culture
Fumehood	Walker	A7277	Used for cell culture
Gel Blotting – Whatman	GE Healthcare	10426981	Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Used to make buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Heating block	Grant	QBT1	Used to heat WB loading samples
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA	ImageJ 1.53e	Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Used to take western blotting images
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	Used for cell culture
Isopropanol	Honeywell	24137	Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)	Novex	NP0008	Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid	Merck Life Sciences UK	M7145	Used for cell culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	Used for preparing lysates for WB
Microplate reader	BioRad	iMark	Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane	Fisher Scientific	45004091	Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Used for cell culture
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Used for cell culture
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Used for immunoprecipitation
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used as component of wash buffer
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L5750	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508	Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Used for cell culture experiment
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Used as component of lysis buffer
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution	Merck Life Sciences UK	T4049	Used for cell culture
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump	Charles Austen	Dymax 5	Used for cell culture
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	Used of mixing resolved sample
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Used to incubate solutions