Dissekering af celle-autonom funktion af skrøbeligt X mentalt retarderingsprotein i et auditivt kredsløb ved In Ovo-elektroporation
Summary
Ved hjælp af ovo elektroporation udtænkte vi en metode til selektivt at transficere det auditive indre øre og cochlearkernen i kyllingembryoner for at opnå en cellegruppespecifik knockdown af skrøbeligt X mentalt retarderingsprotein i diskrete perioder med kredsløbssamling.
Abstract
Fragile X mental retardation protein (FMRP) er et mRNA-bindende protein, der regulerer lokal proteintranslation. FMRP-tab eller dysfunktion fører til afvigende neuronale og synaptiske aktiviteter i skrøbeligt X syndrom (FXS), som er karakteriseret ved intellektuel handicap, sensoriske abnormiteter og sociale kommunikationsproblemer. Undersøgelser af FMRP-funktion og FXS-patogenese er primært blevet udført med Fmr1 (genet, der koder for FMRP) knockout hos transgene dyr. Her rapporterer vi en in vivo-metode til bestemmelse af FMRP’s celleautonome funktion i perioden med kredsløbssamling og synaptisk dannelse ved hjælp af kyllingembryoner. Denne metode anvender fase-, sted- og retningsspecifik elektroporation af et lægemiddelinducerbart vektorsystem indeholdende Fmr1 lille hårnål RNA (shRNA) og en EGFP-reporter. Med denne metode opnåede vi selektiv FMRP-knockdown i den auditive ganglion (AG) og i et af dens hjernestammemål, kernen magnocellularis (NM), hvilket gav en komponentspecifik manipulation inden for AG-NM-kredsløbet. Derudover tillader transfektens mosaikmønster kontrol inden for dyr og nærliggende neuron / fibersammenligninger for forbedret pålidelighed og følsomhed i dataanalyse. Det inducerbare vektorsystem giver tidsmæssig kontrol af genredigeringsstart for at minimere akkumulerende udviklingseffekter. Kombinationen af disse strategier giver et innovativt værktøj til at dissekere FMRP’s celleautonome funktion i synaptisk og kredsløbsudvikling.
Introduction
Fragilt X syndrom (FXS) er en neurodevelopmental lidelse præget af intellektuel handicap, sensoriske abnormiteter og autistisk adfærd. I de fleste tilfælde er FXS forårsaget af et globalt tab af skrøbeligt X mentalt retarderingsprotein (FMRP; kodet af Fmr1-genet), der starter ved tidlige embryonale stadier1. FMRP er et RNA-bindende protein, der normalt udtrykkes i de fleste neuroner og gliaceller i hjernen såvel som i sensoriske organer 2,3,4. I pattedyrhjerner er FMRP sandsynligvis forbundet med hundredvis af mRNA’er, der koder for proteiner, der er vigtige for forskellige neurale aktiviteter5. Undersøgelser af konventionelle Fmr1 knockout-dyr viste, at FMRP-ekspression er særlig vigtig for samlingen og plasticiteten af synaptisk neurotransmission6. Flere betingede og mosaik knockout-modeller har yderligere vist, at FMRP-handlinger og signaler varierer på tværs af hjerneområder, celletyper og synaptiske steder under flere udviklingshændelser, herunder axonal projektion, dendritisk mønster og synaptisk plasticitet 7,8,9,10,11,12,13,14 . Akut funktion af FMRP til regulering af synaptisk transmission blev undersøgt ved intracellulær levering af hæmmende FMRP-antistoffer eller FMRP selv i hjerneskiver eller dyrkede neuroner15,16,17,18. Disse metoder giver imidlertid ikke mulighed for at spore FMRP-fejludtryksinducerede konsekvenser under udviklingen. Der er således et stort behov for at udvikle in vivo-metoder til at undersøge FMRP’s celleautonome funktioner og forventes at hjælpe med at afgøre, om de rapporterede anomalier hos FXS-patienter er direkte konsekvenser af FMRP-tab i de tilknyttede neuroner og kredsløb eller sekundære konsekvenser afledt af netværksdækkende ændringer under udvikling19.
Den auditive hjernestamme af kyllingembryoner tilbyder en unik fordelagtig model til dybdegående funktionelle analyser af FMRP-regulering i kredsløbs- og synapseudvikling. Den lette adgang til embryonale kyllingehjerner og den veletablerede teknik til genmanipulation har i høj grad bidraget til vores forståelse af hjernens udvikling i de tidlige fosterstadier. I en nyligt offentliggjort undersøgelse blev denne teknik kombineret med avancerede molekylære værktøjer, der tillader tidsmæssig kontrol af FMRP-fejludtryk20,21. Her er metoden avanceret til at inducere selektive manipulationer af presynaptiske og postsynaptiske neuroner separat. Denne metode blev udviklet i det auditive hjernestammekredsløb. Akustisk signal detekteres af hårceller i det auditive indre øre og overføres derefter til den auditive ganglion (AG; også kaldet spiralganglion hos pattedyr). Bipolære neuroner i AG innerverer hårceller med deres perifere processer og sender igen en central projektion (hørenerven) til hjernestammen, hvor de ender i to primære cochlearkerner, kernen magnocellularis (NM) og kernen angularis (NA). Neuroner i NM er strukturelt og funktionelt sammenlignelige med de sfæriske buskede celler i pattedyrets anteroventrale cochlear kerne. Inden for NM synapser auditive nervefibre (ANF’er) på somata af NM-neuroner via den store endepære af Held-terminaler22. Under udviklingen opstår NM-neuroner fra rhombomerer 5 og 6 (r5/6) i baghjernen23, mens AG-neuroner er afledt af neuroblaster, der er bosiddende i otocyst24. Her beskriver vi proceduren for selektivt at slå FMRP-ekspression i de presynaptiske AG-neuroner og i de postsynaptiske NM-neuroner separat.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at bestemme FMRP’s celleautonome funktion er det nødvendigt at manipulere dets udtryk i individuelle cellegrupper eller celletyper. Da en af FMRP’s hovedfunktioner er at regulere synaptisk dannelse og plasticitet, er selektiv manipulation af hver synaptisk komponent i et bestemt kredsløb forudsætning for en fuld forståelse af FMRP-mekanismen i synaptisk kommunikation. Ved hjælp af ovo elektroporation af kyllingembryoner demonstrerede vi en metode til at målrette FMRP-ek…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af: et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 32000697); Videnskabs- og teknologiprogrammet i Guangzhou (202102080139); Guangdong Natural Science Foundation (2019A1515110625, 2021A1515010619); de centrale universiteters grundforskningsfonde (11620324) et forskningsstipendium fra Key Laboratory of Regenerative Medicine, Undervisningsministeriet, Jinan University (nr. ZSYXM202107); grundforskningsfondene for de centrale universiteter i Kina (21621054) og Medical Scientific Research Foundation i Guangdong-provinsen i Kina (20191118142729581). Vi takker det medicinske eksperimentelle center på Jinan University. Vi takker Dr. Terra Bradley for omhyggelig redigering af manuskriptet.
Materials
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
Referências
- Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
- Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
- Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
- Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
- Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
- Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
- Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
- Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
- Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
- Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
- Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
- Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
- Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
- Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
- Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
- Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Biologia do Desenvolvimento. 224 (2), 138-151 (2000).
- Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
- Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
- Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
- Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
- Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
- Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
- Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Biologia do Desenvolvimento. 385 (2), 200-210 (2014).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Biologia do Desenvolvimento. 269 (1), 26-35 (2004).
- Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
- Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).
