聴覚回路における脆弱X精神遅滞タンパク質の細胞自律機能をIn Ovo エレクトロポレーション法で解剖
Summary
ovoエレクトロポレーションを用いて、ニワトリ胚の聴覚内耳と蝸牛核を選択的にトランスフェクションし、回路アセンブリの離散期に脆弱X精神遅滞タンパク質の細胞群特異的ノックダウンを達成する方法を考案しました。
Abstract
脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)は、局所タンパク質翻訳を調節するmRNA結合タンパク質です。FMRPの喪失または機能障害は、知的障害、感覚異常、および社会的コミュニケーションの問題を特徴とする脆弱X症候群(FXS)において、異常なニューロンおよびシナプス活動につながります。FMRP機能とFXSの病因の研究は、主にトランスジェニック動物における Fmr1 (FMRPをコードする遺伝子)ノックアウトで行われています。ここでは、ニワトリ胚を用いた回路形成期およびシナプス形成期におけるFMRPの細胞自律機能を決定するための in vivo 法について報告する。この方法は、 Fmr1 低分子ヘアピンRNA(shRNA)とEGFPレポーターを含む薬物誘導性ベクターシステムのステージ、部位、および方向特異的エレクトロポレーションを使用します。この方法では、聴神経節(AG)とその脳幹標的の1つであるマグノセルラリス核(NM)で選択的なFMRPノックダウンを達成し、AG-NM回路内で成分特異的な操作を提供しました。さらに、トランスフェクションのモザイクパターンにより、動物内コントロールや隣接するニューロン/ファイバーの比較が可能になり、データ解析の信頼性と感度が向上します。誘導ベクターシステムは、遺伝子編集開始の時間的制御を提供し、蓄積された発生効果を最小限に抑えます。これらの戦略の組み合わせは、シナプスおよび回路発生におけるFMRPの細胞自律機能を解剖するための革新的なツールを提供します。
Introduction
脆弱X症候群(FXS)は、知的障害、感覚異常、自閉症行動を特徴とする神経発達障害です。ほとんどの場合、FXSは、初期胚期1から始まる脆弱なX精神遅滞タンパク質(FMRP;Fmr1遺伝子によってコードされる)の全体的な喪失によって引き起こされます。FMRPはRNA結合タンパク質であり、通常、脳内のほとんどのニューロンおよびグリア細胞、ならびに感覚器官において発現される2,3,4。哺乳類の脳では、FMRPは、さまざまな神経活動に重要なタンパク質をコードする数百のmRNAに関連している可能性があります5。従来のFmr1ノックアウト動物の研究は、FMRP発現がシナプス神経伝達の集合および可塑性にとって特に重要であることを示した6。いくつかの条件付きおよびモザイクノックアウトモデルは、軸索投影、樹状突起パターニング、およびシナプス可塑性を含むいくつかの発生イベント中に、FMRPアクションおよびシグナルが脳領域、細胞型、およびシナプス部位間で異なることをさらに示しています7,8,9,10,11,12,13,14 .シナプス伝達の調節におけるFMRPの急性機能は、脳スライスまたは培養ニューロンにおける阻害性FMRP抗体またはFMRP自体の細胞内送達によって研究された15、16、17、18。ただし、これらの方法では、開発中にFMRPの誤発現が引き起こす結果を追跡する機能はありません。したがって、FMRPの細胞自律機能を調査するためのin vivoメソッドの開発は非常に必要であり、FXS患者で報告された異常が関連するニューロンおよび回路におけるFMRP喪失の直接的な結果であるか、または開発中のネットワーク全体の変化に由来する二次的な結果であるかを決定するのに役立つと期待されています19。
ニワトリ胚の聴覚脳幹は、回路およびシナプスの発生におけるFMRP調節の詳細な機能解析のための独自の有利なモデルを提供します。ニワトリの胚の脳に簡単にアクセスできることと、遺伝子操作のための確立された卵エレクトロポレーション技術は、初期の胚期における脳の発達の理解に大きく貢献しています。最近発表された研究では、この技術は、FMRPの誤発現の時間的制御を可能にする高度な分子ツールと組み合わされました20,21。ここでは、シナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンの選択的操作を別々に誘導する方法論が進められています。この方法は、聴覚脳幹回路で開発されました。音響信号は、聴覚内耳の有毛細胞によって検出され、聴覚神経節(AG、哺乳類ではらせん神経節とも呼ばれます)に伝達されます。AGの双極性ニューロンは、末梢突起で有毛細胞を神経支配し、次に中枢投影(聴神経)を脳幹に送り、そこで2つの一次蝸牛核、マグノセルラリス核(NM)と角核(NA)で終わります。NMのニューロンは、構造的および機能的に、哺乳類の前腹側蝸牛核の球状のふさふさした細胞に匹敵します。NM内では、聴神経線維(ANF)は、Held端子22の大きな終末球を介してNMニューロンの体細胞上にシナプスする。発生中、NMニューロンは後脳23の菱形5および6(r5/6)から生じ、AGニューロンは耳嚢胞24に存在する神経芽細胞に由来する。ここでは、シナプス前AGニューロンとシナプス後NMニューロンにおけるFMRP発現を選択的にノックダウンする手順を別々に記載する。
Protocol
Representative Results
Discussion
FMRPの細胞自律機能を決定するためには、個々の細胞群または細胞型におけるFMRPの発現を操作する必要があります。FMRPの主要な機能の1つはシナプス形成と可塑性を制御することであるため、特定の回路の各シナプスコンポーネントを選択的に操作することは、シナプス通信におけるFMRPメカニズムを完全に理解するための前提条件です。ニワトリ胚のovoエレク?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学基金会の助成金(No.32000697)によってサポートされました。広州の科学技術プログラム(202102080139);広東自然科学財団(2019A1515110625、2021A1515010619);中央大学の基礎研究費(11620324)済南大学教育部再生医療重点研究所研究助成(No.ZSYXM202107);中国中央大学の基礎研究基金(21621054);中国広東省医学科学研究財団(20191118142729581)。済南大学の医学実験センターに感謝します。原稿を注意深く編集してくれたテラ・ブラッドリー博士に感謝します。
Materials
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
Referências
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