Dissecando a Função Autônoma Celular da Proteína de Retardo Mental do X Frágil em um Circuito Auditivo por Eletroporação In Ovo
Summary
Usando a eletroporação do ovo , desenvolvemos um método para transfectar seletivamente o ouvido interno auditivo e o núcleo coclear em embriões de galinha para alcançar uma derrubada específica do grupo celular da proteína de retardo mental X frágil durante períodos discretos de montagem do circuito.
Abstract
A proteína de retardo mental do X frágil (FMRP) é uma proteína de ligação ao mRNA que regula a tradução de proteínas locais. A perda ou disfunção da FMRP leva a atividades neuronais e sinápticas aberrantes na síndrome do X frágil (FXS), que é caracterizada por deficiência intelectual, anormalidades sensoriais e problemas de comunicação social. Estudos da função da FMRP e da patogênese da FXS foram conduzidos principalmente com o knockout de Fmr1 (o gene que codifica a FMRP) em animais transgênicos. Aqui relatamos um método in vivo para determinar a função autônoma celular da FMRP durante o período de montagem do circuito e formação sináptica usando embriões de galinha. Este método emprega eletroporação específica de estágio, local e direção de um sistema vetorial induzível por droga contendo Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) e um repórter EGFP. Com este método, obteve-se o knockdown seletivo da FMRP no gânglio auditivo (GA) e em um de seus alvos do tronco encefálico, o núcleo magnocelular (NM), proporcionando assim uma manipulação componente-específica dentro do circuito AG-NM. Além disso, o padrão de mosaico da transfecção permite controles dentro de animais e comparações de neurônios / fibras vizinhas para maior confiabilidade e sensibilidade na análise de dados. O sistema vetorial induzível fornece controle temporal do início da edição gênica para minimizar os efeitos acumulados no desenvolvimento. A combinação dessas estratégias fornece uma ferramenta inovadora para dissecar a função autônoma celular da FMRP no desenvolvimento sináptico e de circuitos.
Introduction
A síndrome do X Frágil (FXS) é um transtorno do neurodesenvolvimento caracterizado por deficiência intelectual, anormalidades sensoriais e comportamentos autistas. Na maioria dos casos, a FXS é causada por uma perda global de proteína de retardo mental X frágil (FMRP; codificada pelo gene Fmr1) a partir dos estágios embrionários iniciais1. A FMRP é uma proteína ligadora de RNA que normalmente é expressa na maioria dos neurônios e células gliais do cérebro, bem como nos órgãos sensoriais 2,3,4. Em cérebros de mamíferos, a FMRP provavelmente está associada a centenas de mRNAs que codificam proteínas importantes para várias atividades neurais5. Estudos de animais knockout Fmr1 convencionais demonstraram que a expressão de FMRP é particularmente importante para a montagem e plasticidade da neurotransmissão sináptica6. Vários modelos de knockout condicional e mosaico demonstraram ainda que as ações e sinais da FMRP variam entre regiões cerebrais, tipos de células e sítios sinápticos durante vários eventos de desenvolvimento, incluindo projeção axonal, padronização dendrítica e plasticidade sináptica 7,8,9,10,11,12,13,14 . A função aguda da PRFM na regulação da transmissão sináptica foi estudada pela liberação intracelular de anticorpos inibitórios da PRFM ou da própria PRFM em cortes cerebrais ou neurônios cultivados15,16,17,18. Esses métodos, no entanto, não oferecem a capacidade de rastrear as consequências induzidas por erros de expressão da FMRP durante o desenvolvimento. Assim, o desenvolvimento de métodos in vivo para investigar as funções autônomas celulares da FMRP é de grande necessidade e espera-se que ajude a determinar se as anomalias relatadas em pacientes com FXS são consequências diretas da perda de FMRP nos neurônios e circuitos associados, ou consequências secundárias derivadas de mudanças em toda a rede durante o desenvolvimento19.
O tronco encefálico auditivo de embriões de galinha oferece um modelo excepcionalmente vantajoso para análises funcionais aprofundadas da regulação da FMRP no desenvolvimento de circuitos e sinapses. O fácil acesso a cérebros de galinhas embrionárias e a técnica bem estabelecida de eletroporação de ovoterapia para manipulação genética contribuíram grandemente para a nossa compreensão do desenvolvimento cerebral em estágios embrionários iniciais. Em estudo recentemente publicado, essa técnica foi combinada com ferramentas moleculares avançadas que permitem o controle temporal da expressão incorreta daPRFM 20,21. Aqui, a metodologia é avançada para induzir manipulações seletivas de neurônios pré-sinápticos e pós-sinápticos separadamente. Este método foi desenvolvido no circuito auditivo de tronco encefálico. O sinal acústico é detectado pelas células ciliadas no ouvido interno auditivo e, em seguida, transportado para o gânglio auditivo (AG; também chamado de gânglio espiral em mamíferos). Os neurônios bipolares no GA inervam as células ciliadas com seus processos periféricos e, por sua vez, enviam uma projeção central (o nervo auditivo) para o tronco encefálico, onde terminam em dois núcleos cocleares primários, o núcleo magnocelular (NM) e o núcleo angularis (NA). Os neurônios no NM são estrutural e funcionalmente comparáveis às células espessas esféricas do núcleo coclear anteroventral de mamíferos. Dentro do NM, as fibras nervosas auditivas (FANs) fazem sinapse na somata dos neurônios NM através do grande bulbo final dos terminais de Held22. Durante o desenvolvimento, os neurônios NM surgem dos rombomeres 5 e 6 (r5/6) no rombencéfalo23, enquanto os neurônios AG são derivados de neuroblastos residentes no otocisto24. Aqui, descrevemos o procedimento para derrubar seletivamente a expressão de FMRP nos neurônios AG pré-sinápticos e nos neurônios NM pós-sinápticos separadamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para determinar a função autônoma celular da FMRP, é necessário manipular sua expressão em grupos celulares individuais ou tipos de células. Uma vez que uma das principais funções da FMRP é regular a formação sináptica e a plasticidade, manipular seletivamente cada componente sináptico de um determinado circuito é pré-requisito para uma compreensão completa do mecanismo FMRP na comunicação sináptica. Utilizando na ovoporação embriões de galinha, demonstramo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por: uma bolsa da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 32000697); o Programa de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (202102080139); a Fundação de Ciências Naturais de Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); os Fundos de Investigação Fundamental para as Universidades Centrais (11620324); uma Bolsa de Pesquisa do Laboratório Chave de Medicina Regenerativa, Ministério da Educação, Universidade de Jinan (No. ZSYXM202107); os Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais da China (21621054); e a Fundação de Pesquisa Científica Médica da Província de Guangdong, na China (20191118142729581). Agradecemos ao centro médico experimental da Universidade de Jinan. Agradecemos ao Dr. Terra Bradley pela cuidadosa edição do manuscrito.
Materials
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
Referências
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