Рассечение клеточно-автономной функции хрупкого белка умственной отсталости X в слуховой цепи с помощью электропорации In Ovo
Summary
Используя электропорацию ово , мы разработали метод селективной трансфекции слухового внутреннего уха и кохлеарного ядра у куриных эмбрионов для достижения специфического для клеточной группы нокдауна хрупкого белка умственной отсталости X в течение дискретных периодов сборки цепи.
Abstract
Хрупкий белок умственной отсталости X (FMRP) является мРНК-связывающим белком, который регулирует локальную трансляцию белка. Потеря или дисфункция FMRP приводит к аберрантной нейрональной и синаптической активности при синдроме хрупкого X (FXS), который характеризуется умственной отсталостью, сенсорными аномалиями и проблемами социальной коммуникации. Исследования функции FMRP и патогенеза FXS в основном проводились с нокаутом Fmr1 (ген, кодирующий FMRP) у трансгенных животных. Здесь мы сообщаем о методе in vivo для определения клеточно-автономной функции FMRP в период сборки цепи и синаптического образования с использованием куриных эмбрионов. Этот метод использует стадийную, участковую и направленную электропорацию векторной системы, индуцируемой лекарственным средством, содержащей небольшую шпильковую РНК Fmr1 (шРНК) и репортер EGFP. С помощью этого метода мы достигли селективного нокдауна FMRP в слуховом ганглии (AG) и в одной из его мишеней ствола мозга, ядре magnocellularis (NM), тем самым обеспечивая компонентно-специфическую манипуляцию в цепи AG-NM. Кроме того, мозаичный рисунок трансфекции позволяет проводить внутри животных контроль и сравнение соседних нейронов / волокон для повышения надежности и чувствительности при анализе данных. Индуцируемая векторная система обеспечивает временной контроль начала редактирования генов, чтобы свести к минимуму накапливающиеся эффекты развития. Сочетание этих стратегий обеспечивает инновационный инструмент для препарирования клеточно-автономной функции FMRP в синаптическом и схемном развитии.
Introduction
Синдром хрупкой Х (FXS) — это расстройство нервного развития, характеризующееся умственной отсталостью, сенсорными аномалиями и аутистическим поведением. В большинстве случаев FXS вызван глобальной потерей хрупкого белка умственной отсталости X (FMRP; кодируется геном Fmr1), начиная с ранних эмбриональных стадий1. FMRP представляет собой РНК-связывающий белок, который обычно экспрессируется в большинстве нейронов и глиальных клеток головного мозга, а также ворганах чувств 2,3,4. В мозге млекопитающих FMRP, вероятно, связан с сотнями мРНК, которые кодируют белки, важные для различных нейронных активностей5. Исследования обычных нокаутирующих животных Fmr1 показали, что экспрессия FMRP особенно важна для сборки и пластичности синаптической нейротрансмиссии6. Несколько условных и мозаичных нокаутных моделей дополнительно продемонстрировали, что действия и сигналы FMRP варьируются в разных областях мозга, типах клеток и синаптических участках во время нескольких событий развития, включая аксональную проекцию, дендритный паттерн и синаптическую пластичность 7,8,9,10,11,12,13,14 . Острая функция FMRP в регуляции синаптической передачи изучалась внутриклеточной доставкой ингибирующих антител FMRP или самой FMRP в срезах мозга или культивируемых нейронах 15,16,17,18. Эти методы, однако, не дают возможности отслеживать последствия, вызванные неправильной экспрессией FMRP, во время развития. Таким образом, разработка методов in vivo для исследования клеточно-автономных функций FMRP очень необходима и, как ожидается, поможет определить, являются ли зарегистрированные аномалии у пациентов с FXS прямыми последствиями потери FMRP в ассоциированных нейронах и цепях или вторичными последствиями, полученными из общесетевых изменений во время развития19.
Слуховой ствол мозга куриных эмбрионов предлагает уникально выгодную модель для углубленного функционального анализа регуляции FMRP в цепном и синапсовом развитии. Легкий доступ к эмбриональному куриному мозгу и хорошо зарекомендовавшая себя техника электропорации в ово для генетических манипуляций в значительной степени способствовали нашему пониманию развития мозга на ранних эмбриональных стадиях. В недавно опубликованном исследовании этот метод был объединен с передовыми молекулярными инструментами, которые позволяют временно контролировать неправильную экспрессию FMRP20,21. Здесь усовершенствована методология индуцирования селективных манипуляций с пресинаптическими и постсинаптическими нейронами по отдельности. Этот метод был разработан в слуховой цепи ствола мозга. Акустический сигнал обнаруживается волосковыми клетками в слуховом внутреннем ухе, а затем передается в слуховой ганглий (AG; также называемый спиральным ганглием у млекопитающих). Биполярные нейроны в АГ иннервируют волосковые клетки своими периферическими отростками и, в свою очередь, посылают центральную проекцию (слуховой нерв) в ствол мозга, где они заканчиваются двумя первичными кохлеарными ядрами, ядром magnocellularis (NM) и ядром angularis (NA). Нейроны в НМ структурно и функционально сопоставимы со сферическими кустистыми клетками антеровентрального кохлеарного ядра млекопитающих. В NM, слуховые нервные волокна (ANF) синапс на соматах nm нейронов через большую конечную бульбу Held terminals22. Во время развития нейроны NM возникают из ромбомеров 5 и 6 (r5/6) в заднем мозге23, в то время как нейроны AG получены из нейробластов, находящихся в отоцисте24. Здесь мы описываем процедуру селективного сбивания экспрессии FMRP в пресинаптических нейронах AG и в постсинаптических нейронах NM по отдельности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для определения клеточно-автономной функции FMRP необходимо манипулировать его экспрессией в отдельных клеточных группах или типах клеток. Поскольку одной из основных функций FMRP является регулирование синаптического образования и пластичности, избирательное манипу?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано: грантом Национального фонда естественных наук Китая (No 32000697); Научно-техническая программа Гуанчжоу (202102080139); Гуандунский фонд естественных наук (2019A1515110625, 2021A1515010619); Фонды фундаментальных исследований центральных университетов (11620324); Исследовательский грант Ключевой лаборатории регенеративной медицины, Министерство образования, Университет Цзинань (No. ZSYXM202107); Фонды фундаментальных исследований для центральных университетов Китая (21621054); и Фонд медицинских научных исследований китайской провинции Гуандун (20191118142729581). Благодарим медицинский экспериментальный центр Университета Цзинань. Мы благодарим доктора Терру Брэдли за тщательное редактирование рукописи.
Materials
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
Referências
- Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
- Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
- Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
- Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
- Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
- Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
- Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
- Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
- Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
- Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
- Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
- Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
- Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
- Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
- Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
- Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Biologia do Desenvolvimento. 224 (2), 138-151 (2000).
- Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
- Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
- Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
- Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
- Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
- Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
- Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Biologia do Desenvolvimento. 385 (2), 200-210 (2014).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Biologia do Desenvolvimento. 269 (1), 26-35 (2004).
- Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
- Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).
