Identifizierung von Caspasen und ihren Motiven, die Proteine während einer Influenza-A-Virusinfektion spalten
Summary
Die Infektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV) aktiviert die Caspasen, die Wirts- und Virusproteine spalten, die wiederum pro- und antivirale Funktionen haben. Durch den Einsatz von Inhibitoren, RNA-Interferenz, ortsgerichteter Mutagenese und Western Blotting und RT-qPCR-Techniken wurden Caspasen in infizierten Säugetierzellen identifiziert, die Wirtscortactin- und Histon-Deacetylasen spalten.
Abstract
Caspasen, eine Familie von Cysteinproteasen, orchestrieren den programmierten Zelltod als Reaktion auf verschiedene Reize, einschließlich mikrobieller Infektionen. Ursprünglich als Apoptose beschrieben, ist heute bekannt, dass der programmierte Zelltod drei miteinander verbundene Wege umfasst: Pyroptose, Apoptose und Nekroptose, die zusammen als ein Prozess, PANoptose, bezeichnet werden. Einfluss Eine Virusinfektion (IAV) induziert PANoptose in Säugetierzellen, indem sie die Aktivierung verschiedener Caspasen induziert, die wiederum verschiedene Wirts- und virale Proteine spalten, was zu Prozessen wie der Aktivierung der angeborenen antiviralen Antwort des Wirts oder dem Abbau antagonistischer Wirtsproteine führt. In dieser Hinsicht wurde eine Caspase-3-vermittelte Spaltung von Wirtscortactin, Histon-Deacetylase 4 (HDAC4) und Histon-Deacetylase 6 (HDAC6) sowohl in tierischen als auch in menschlichen Epithelzellen als Reaktion auf die IAV-Infektion entdeckt. Um dies zu demonstrieren, wurden Inhibitoren, RNA-Interferenz und ortsgerichtete Mutagenese eingesetzt, und anschließend wurden die Spaltung oder Resistenz gegen Spaltung und die Erholung von Cortactin-, HDAC4- und HDAC6-Polypeptiden durch Western Blotting gemessen. Diese Methoden bilden in Verbindung mit der RT-qPCR eine einfache, aber effektive Strategie, um den Wirt sowie virale Proteine zu identifizieren, die während einer Infektion mit IAV oder anderen menschlichen und tierischen Viren eine Caspase-vermittelte Spaltung durchlaufen. Das vorliegende Protokoll erarbeitet die repräsentativen Ergebnisse dieser Strategie, und es werden auch die Möglichkeiten diskutiert, sie wirksamer zu gestalten.
Introduction
Das Influenza-A-Virus (IAV) ist das prototypische Mitglied der Familie der Orthomyxoviridae und ist dafür bekannt, globale Epidemien und unvorhersehbare Pandemien zu verursachen. IAV verursacht menschliche Atemwegserkrankungen, Influenza, allgemein bekannt als “Grippe”. Die Grippe ist eine akute Erkrankung, die zur Induktion wirtspro- und entzündungshemmender angeborener Immunantworten und zum Absterben von Epithelzellen in den menschlichen Atemwegen führt. Beide Prozesse werden von einem Phänomen gesteuert, das als programmierter Zelltodbezeichnet wird 1. Die Signalisierung für den programmierten Zelltod wird induziert, sobald verschiedene Erregererkennungsrezeptoren die ankommenden Viruspartikel in Wirtszellen wahrnehmen. Dies führt zur Programmierung des Todes infizierter Zellen und zur Signalisierung an die benachbarten gesunden Zellen durch drei miteinander verbundene Signalwege, die Pyroptose, Apoptose und Nekroptose genannt werden – kürzlich als ein Prozess, PANoptose1, geprägt.
Die PANoptose beinhaltet die proteolytische Verarbeitung vieler Wirts- und Virusproteine von der Induktion bis zur Ausführung. Diese Verarbeitung von Proteinen wird hauptsächlich von einer Familie von Cysteinproteasen angeführt, die Caspasen 1,2 genannt werden. Bis zu 18 Caspasen (von Caspase 1 bis Caspase 18) sind bekannt3. Die meisten Caspasen werden als Pro-Caspasen exprimiert und durch ihre eigene proteolytische Verarbeitung entweder durch Autokatalyse oder andere Caspasen4 als Reaktion auf einen Reiz wie eine Virusinfektion aktiviert. Die PANoptose von IAV-infizierten Zellen wurde als Abwehrmechanismus des Wirts angesehen, aber IAV hat Wege entwickelt, um sie zu umgehen und auszunutzen, um ihre Replikation zu erleichtern 1,2,5,6. Eine davon besteht darin, die Wirtsfaktoren durch Caspase-vermittelte Spaltung oder Abbau zu antagonisieren, die entweder inhärent antiviral sind oder einen der Schritte des IAV-Lebenszyklus stören. Zu diesem Zweck wurde entdeckt, dass die Wirtsfaktoren Cortactin, HDAC4 und HDAC6 in IAV-infizierten Epithelzellen eine Caspase-vermittelte Spaltung oder Degradation durchlaufen 7,8,9. HDAC4 und HDAC6 sind Anti-IAV-Faktoren 8,10, und Cortactin stört die IAV-Replikation in einem späteren Stadium der Infektion, möglicherweise während der viralen Assemblierung und Knospung 11.
Darüber hinaus werden auch verschiedene Caspasen aktiviert, die wiederum mehrere Proteine spalten, um die Entzündungsreaktion des Wirts während der IAV-Infektion zu aktivieren 1,2. Darüber hinaus durchlaufen Nukleoprotein (NP), Ionenkanal-M2-Protein von IAV 12,13,14 und verschiedene Proteine anderer Viren 3,15,16 während der Infektion ebenfalls eine Caspase-vermittelte Spaltung, die die virale Pathogenese beeinflusst. Daher besteht ein kontinuierlicher Bedarf, die Caspase-vermittelte Spaltung oder den Abbau von Wirts- und Virusproteinen während IAV- und anderer Virusinfektionen zu untersuchen, um die molekularen Grundlagen der viralen Pathogenese zu verstehen. Hierin werden die Verfahren vorgestellt, um (1) die Spaltung oder den Abbau solcher Proteine durch Caspasen zu bewerten, (2) diese Caspasen zu identifizieren und (3) die Spaltstellen zu lokalisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist erwiesen, dass Viren die Wirtsfaktoren und -wege zu ihrem Vorteil anpassen. Die Wirtszellen wiederum wehren sich dagegen, indem sie verschiedene Strategien anwenden. Eine dieser Strategien ist die PANoptose, die Wirtszellen als antivirale Strategie gegen Virusinfektionen einsetzen. Viren wie IAV haben jedoch ihre eigenen Strategien entwickelt, um der PANoptose entgegenzuwirken und sie zu ihrem Vorteil auszunutzen 1,3,6. D…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor dankt Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, den BEI Resources (NIAID), dem Health Research Council of New Zealand, dem Maurice and Phyllis Paykel Trust (Neuseeland), dem H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin) und dem Department of Microbiology and Immunology und der School of Biomedical Sciences (University of Otago).
Materials
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
Referências
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