इन्फ्लुएंजा ए वायरस संक्रमण के दौरान प्रोटीन को छोड़ने वाले कैसपेस और उनके रूपांकनों की पहचान करना
Summary
इन्फ्लुएंजा ए वायरस (आईएवी) संक्रमण कैसपेस को सक्रिय करता है जो मेजबान और वायरल प्रोटीन को छोड़ देता है, जो बदले में, प्रो-और एंटीवायरल कार्य करता है। अवरोधकों, आरएनए हस्तक्षेप, साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस, और पश्चिमी सोख्ता और आरटी-क्यूपीसीआर तकनीकों को नियोजित करके, संक्रमित स्तनधारी कोशिकाओं में कैसपेस की पहचान की गई जो मेजबान कोर्टैक्टिन और हिस्टोन डेसेटाइलेज़ को छोड़ देते हैं।
Abstract
कैसपेस, सिस्टीन प्रोटीज का एक परिवार, माइक्रोबियल संक्रमण सहित विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का आयोजन करता है। प्रारंभ में एपोप्टोसिस द्वारा वर्णित, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु को अब तीन परस्पर जुड़े मार्गों को शामिल करने के लिए जाना जाता है: पाइरोप्टोसिस, एपोप्टोसिस और नेक्रोप्टोसिस, एक साथ एक प्रक्रिया के रूप में गढ़ा गया, पीएनोप्टोसिस। ए वायरस (आईएवी) संक्रमण स्तनधारी कोशिकाओं में विभिन्न कैसपेस की सक्रियता को प्रेरित करके पीएनोपोसिस को प्रेरित करता है, जो बदले में, विभिन्न मेजबान के साथ-साथ वायरल प्रोटीन को छोड़ देता है, जिससे मेजबान जन्मजात एंटीवायरल प्रतिक्रिया की सक्रियता या विरोधी मेजबान प्रोटीन के क्षरण जैसी प्रक्रियाएं होती हैं। इस संबंध में, आईएवी संक्रमण के जवाब में पशु और मानव उपकला कोशिकाओं दोनों में मेजबान कोर्टैक्टिन, हिस्टोन डेसेटाइलेज़ 4 (एचडीएसी 4), और हिस्टोन डेसेटाइलेज़ 6 (एचडीएसी 6) के कैसपेस 3-मध्यस्थता दरार की खोज की गई है। इसे प्रदर्शित करने के लिए, अवरोधकों, आरएनए हस्तक्षेप और साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस को नियोजित किया गया था, और, बाद में, दरार या दरार के प्रतिरोध और कोर्टैक्टिन, एचडीएसी 4 और एचडीएसी 6 पॉलीपेप्टाइड्स की वसूली को पश्चिमी सोख्ता द्वारा मापा गया था। आरटी-क्यूपीसीआर के साथ संयोजन में ये विधियां, आईएवी या अन्य मानव और पशु वायरस के संक्रमण के दौरान कैसपेज़-मध्यस्थता दरार से गुजरने वाले मेजबान के साथ-साथ वायरल प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक सरल लेकिन प्रभावी रणनीति बनाती हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल इस रणनीति के प्रतिनिधि परिणामों को विस्तृत करता है, और इसे और अधिक प्रभावी बनाने के तरीकों पर भी चर्चा की जाती है।
Introduction
इन्फ्लुएंजा ए वायरस (आईएवी) ऑर्थोमाइक्सोविरिडे परिवार का प्रोटोटाइप सदस्य है और इसे वैश्विक महामारी और अप्रत्याशित महामारी का कारण माना जाता है। आईएवी मानव श्वसन रोग, इन्फ्लूएंजा का कारण बनता है, जिसे आमतौर पर “फ्लू” के रूप में जाना जाता है। फ्लू एक तीव्र बीमारी है जिसके परिणामस्वरूप मेजबान समर्थक और विरोधी भड़काऊ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का प्रेरण होता है और मानव श्वसन पथ में उपकला कोशिकाओं की मृत्यु हो जाती है। दोनों प्रक्रियाएं प्रोग्राम्ड सेल डेथ1 नामक एक घटना द्वारा नियंत्रित होती हैं। प्रोग्राम्ड सेल डेथ के लिए सिग्नलिंग को प्रेरित किया जाता है जैसे ही विभिन्न रोगज़नक़ पहचान रिसेप्टर्स मेजबान कोशिकाओं में आने वाले वायरस कणों को महसूस करते हैं। यह संक्रमित कोशिकाओं की मृत्यु की प्रोग्रामिंग की ओर जाता है और पड़ोसी स्वस्थ कोशिकाओं को पाइरोप्टोसिस, एपोप्टोसिस और नेक्रोप्टोसिस नामक तीन परस्पर मार्गों द्वारा संकेत देता है- जिसे हाल ही में एक प्रक्रिया के रूप में गढ़ा गया है, पीएनोप्टोसिस1।
पीएनोप्टोसिस में प्रेरण से निष्पादन तक कई मेजबान और वायरल प्रोटीन के प्रोटियोलिटिक प्रसंस्करण शामिल हैं। प्रोटीन के इस तरह के प्रसंस्करण को मुख्य रूप से सिस्टीन प्रोटीज के एक परिवार द्वारा नेतृत्व किया जाता है जिसे कैसपेज़ 1,2 कहा जाता है। 18 कैसपेज़ (कैसपेज़ 1 से कैसपेज़ 18 तक) तक3 ज्ञात हैं। अधिकांश कैसपेस को प्रो-कैसपेज़ के रूप में व्यक्त किया जाता है और वायरस संक्रमण जैसी उत्तेजना के जवाब में ऑटोकैटालिसिस या अन्य कैसपेज़4 द्वारा अपने स्वयं के प्रोटियोलिटिक प्रसंस्करण से गुजरकर सक्रिय किया जाता है। आईएवी-संक्रमित कोशिकाओं के पीएनोप्टोसिस को एक मेजबान रक्षा तंत्र माना जाता था, लेकिन आईएवी ने इसकी प्रतिकृति 1,2,5,6 को सुविधाजनक बनाने के लिए इससे बचने और इसका फायदा उठाने के तरीके विकसित किए हैं। उनमें से एक कैसपेज़-मध्यस्थता दरार या गिरावट के माध्यम से मेजबान कारकों का विरोध करना है जो या तो स्वाभाविक रूप से एंटीवायरल हैं या आईएवी जीवन चक्र के चरणों में से एक में हस्तक्षेप करते हैं। इसके लिए, मेजबान कारक, कोर्टैक्टिन, एचडीएसी 4, और एचडीएसी 6 को आईएवी-संक्रमित उपकला कोशिकाओं 7,8,9 में कैसपेज़-मध्यस्थता दरार या गिरावट से गुजरने के लिए खोजा गया है। एचडीएसी 4 और एचडीएसी 6 एंटी-आईएवी कारक 8,10 हैं, और कोर्टैक्टिन संक्रमण के बाद के चरण में आईएवी प्रतिकृति में हस्तक्षेप करता है, संभवतः वायरल असेंबली और नवोदित11 के दौरान।
इसके अलावा, विभिन्न कैसपेस भी सक्रिय होते हैं, जो बदले में, आईएवी संक्रमण 1,2 के दौरान मेजबान भड़काऊ प्रतिक्रिया को सक्रिय करने के लिए कई प्रोटीन छोड़ देते हैं। इसके अलावा, न्यूक्लियोप्रोटीन (एनपी), आईएवी12,13,14 के आयन-चैनल एम 2 प्रोटीन, और अन्य वायरस 3,15,16 के विभिन्न प्रोटीन भी संक्रमण के दौरान कैसपेज़-मध्यस्थता दरार से गुजरते हैं, जो वायरल रोगजनन को प्रभावित करता है। इसलिए, वायरल रोगजनन के आणविक आधार को समझने के लिए आईएवी और अन्य वायरस संक्रमणों के दौरान कैसपेस-मध्यस्थता दरार या मेजबान और वायरल प्रोटीन के क्षरण का अध्ययन करने की निरंतर आवश्यकता है। इसमें, विधियों को प्रस्तुत किया जाता है (1) कैसपेस द्वारा ऐसे प्रोटीन की दरार या गिरावट का आकलन करना, (2) उन कैसपेस की पहचान करना, और (3) दरार साइटों का पता लगाना।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह स्थापित किया गया है कि वायरस अपने लाभ के लिए मेजबान कारकों और मार्गों को तैयार करते हैं। बदले में, मेजबान कोशिकाएं विभिन्न रणनीतियों को नियोजित करके इसका विरोध करती हैं। उन रणनीतियों में से एक पीएन?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक जेनिफर टिपर, बिलन ली, जेसी वैनवेस्ट्रिनेन, केविन हैरोड, दा-युआन चेन, फरजाना अहमद, सोन्या मोरोस, केनेथ यामादा, रिचर्ड वेबबी, बीईआई रिसोर्सेज (एनआईएआईडी), न्यूजीलैंड की स्वास्थ्य अनुसंधान परिषद, मौरिस और फिलिस पेकेल ट्रस्ट (न्यूजीलैंड), एचएस और जेसी एंडरसन ट्रस्ट (डुनेडिन), और माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी विभाग और बायोमेडिकल साइंसेज (ओटागो विश्वविद्यालय) को स्वीकार करते हैं।
Materials
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
Referências
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