Identificación de caspasas y sus motivos que escinden proteínas durante la infección por el virus de la influenza A
Summary
La infección por el virus de la influenza A (IAV) activa las caspasas que escinden las proteínas del huésped y virales, que, a su vez, tienen funciones pro y antivirales. Mediante el empleo de inhibidores, interferencia de ARN, mutagénesis dirigida al sitio y técnicas de Western blotting y RT-qPCR, se identificaron caspasas en células de mamíferos infectadas que escinden cortactina del huésped e histonas desacetilasas.
Abstract
Las caspasas, una familia de proteasas de cisteína, orquestan la muerte celular programada en respuesta a diversos estímulos, incluidas las infecciones microbianas. Inicialmente descrito como que ocurre por apoptosis, ahora se sabe que la muerte celular programada abarca tres vías interconectadas: piroptosis, apoptosis y necroptosis, acuñadas juntas como un proceso, PANoptosis. La infección por el virus Influence A (IAV) induce PANoptosis en células de mamíferos al inducir la activación de diferentes caspasas, que, a su vez, escinden varias proteínas del huésped y virales, lo que lleva a procesos como la activación de la respuesta antiviral innata del huésped o la degradación de proteínas antagónicas del huésped. En este sentido, se ha descubierto escisión mediada por caspasa 3 de la cortactina del huésped, la histona desacetilasa 4 (HDAC4) y la histona desacetilasa 6 (HDAC6) en células epiteliales animales y humanas en respuesta a la infección por IAV. Para demostrarlo, se emplearon inhibidores, interferencia de ARN y mutagénesis dirigida al sitio y, posteriormente, se midió la escisión o resistencia a la escisión y la recuperación de los polipéptidos cortactina, HDAC4 y HDAC6 mediante western blotting. Estos métodos, junto con RT-qPCR, forman una estrategia simple pero efectiva para identificar el huésped, así como las proteínas virales que experimentan escisión mediada por caspasa durante una infección de IAV u otros virus humanos y animales. En el presente protocolo se elaboran los resultados representativos de esta estrategia, y también se examinan las formas de hacerla más eficaz.
Introduction
El virus de la influenza A (IAV) es el miembro prototípico de la familia Orthomyxoviridae y se sabe que causa epidemias globales y pandemias impredecibles. IAV causa enfermedad respiratoria humana, gripe, comúnmente conocida como “gripe”. La gripe es una enfermedad aguda que resulta en la inducción de respuestas inmunes innatas pro y antiinflamatorias del huésped y la muerte de las células epiteliales en el tracto respiratorio humano. Ambos procesos están gobernados por un fenómeno llamado muerte celular programada1. La señalización para la muerte celular programada se induce tan pronto como varios receptores de reconocimiento de patógenos detectan las partículas de virus entrantes en las células huésped. Esto conduce a la programación de la muerte de las células infectadas y la señalización a las células sanas vecinas por tres vías interconectadas llamadas piroptosis, apoptosis y necroptosis, recientemente acuñadas como un proceso, PANoptosis1.
La PANoptosis implica el procesamiento proteolítico de muchas proteínas del huésped y virales desde la inducción hasta la ejecución. Tal procesamiento de proteínas está encabezado principalmente por una familia de proteasas de cisteína llamadas caspasas 1,2. Se conocen hasta 18 caspasas (de caspasa 1 a caspasa 18)3. La mayoría de las caspasas se expresan como pro-caspasas y se activan al someterse a su propio procesamiento proteolítico, ya sea por autocatálisis u otras caspasas4 en respuesta a un estímulo como una infección viral. Se pensaba que la PANoptosis de las células infectadas por IAV era un mecanismo de defensa del huésped, pero IAV ha desarrollado formas de evadirlo y explotarlo para facilitar su replicación 1,2,5,6. Uno de ellos es antagonizar los factores del huésped a través de la escisión o degradación mediada por caspasa que son inherentemente antivirales o interfieren con uno de los pasos del ciclo de vida del IAV. Con este fin, se ha descubierto que los factores del huésped, cortactina, HDAC4 y HDAC6 sufren escisión o degradación mediada por caspasa en células epiteliales infectadas por IAV 7,8,9. El HDAC4 y el HDAC6 son factores anti-IAV 8,10, y la cortactina interfiere con la replicación del IAV en una etapa posterior de la infección, potencialmente durante el ensamblaje viral y la gemación11.
Además, también se activan varias caspasas, que, a su vez, escinden múltiples proteínas para activar la respuesta inflamatoria del huésped durante la infección por IAV 1,2. Además, la nucleoproteína (NP), la proteína M2 del canal iónico de IAV 12,13,14 y varias proteínas de otros virus 3,15,16 también sufren escisión mediada por caspasa durante la infección, lo que influye en la patogénesis viral. Por lo tanto, existe una necesidad continua de estudiar la escisión mediada por caspasa o la degradación de las proteínas del huésped y virales durante el IAV y otras infecciones virales para comprender las bases moleculares de la patogénesis viral. En este documento, los métodos se presentan para (1) evaluar la escisión o degradación de dichas proteínas por caspasas, (2) identificar esas caspasas, y (3) localizar los sitios de escisión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se establece que los virus adaptan los factores y vías del huésped para su beneficio. A su vez, las células huésped se resisten a eso empleando varias estrategias. Una de esas estrategias es la PANoptosis, que las células huésped utilizan como estrategia antiviral contra las infecciones por virus. Sin embargo, virus como IAV han desarrollado sus propias estrategias para contrarrestar la PANoptosis y explotarla en su beneficio 1,3,6.<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor reconoce a Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), el Health Research Council of New Zealand, el Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nueva Zelanda), el H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin), y el Departamento de Microbiología e Inmunología y la Facultad de Ciencias Biomédicas (Universidad de Otago).
Materials
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
Referências
- Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -. D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
- Zheng, M., Kanneganti, T. -. D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
- Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
- Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
- Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
- Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
- Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
- Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
- Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
- Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
- Zhirnov, O. P., Klenk, H. -. D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
- Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
- Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
- Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
- Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
- Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
- Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
- Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, 160-164 (2004).
- Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
- Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, 290-297 (2015).
