Summary

Identifiera kaspaser och deras motiv som klyver proteiner under influensa A-virusinfektion

Published: July 21, 2022
doi:

Summary

Influensa A-virus (IAV) -infektion aktiverar de caspaser som klyver värd- och virusproteiner, som i sin tur har pro- och antivirala funktioner. Genom att använda hämmare, RNA-interferens, platsriktad mutagenes och western blotting- och RT-qPCR-tekniker identifierades kaspaser i infekterade däggdjursceller som klyver värdkortaktin och histondeacetylaser.

Abstract

Caspaser, en familj av cysteinproteaser, orkestrerar programmerad celldöd som svar på olika stimuli, inklusive mikrobiella infektioner. Ursprungligen beskrivet att inträffa genom apoptos, är programmerad celldöd nu känd för att omfatta tre sammankopplade vägar: pyroptos, apoptos och nekroptos, tillsammans myntade som en process, PANoptosis. Påverkan A-virusinfektion (IAV) inducerar PANoptos i däggdjursceller genom att inducera aktivering av olika caspaser, som i sin tur klyver olika värd- såväl som virala proteiner, vilket leder till processer som aktivering av värdens medfödda antivirala svar eller nedbrytning av antagonistiska värdproteiner. I detta avseende har kaspas-3-medierad klyvning av värdkortatin, histondeacetylas 4 (HDAC4) och histondeacetylas 6 (HDAC6) upptäckts i både djur- och humanepitelceller som svar på IAV-infektionen. För att demonstrera detta användes hämmare, RNA-interferens och platsriktad mutagenes, och därefter mättes klyvningen eller motståndet mot klyvning och återvinning av kortattin-, HDAC4- och HDAC6-polypeptider med western blotting. Dessa metoder, i kombination med RT-qPCR, bildar en enkel men effektiv strategi för att identifiera värden såväl som virala proteiner som genomgår kaspasmedierad klyvning under en infektion av IAV eller andra mänskliga och djurvirus. I detta protokoll utvecklas de representativa resultaten av denna strategi, och sätten att göra den mer effektiv diskuteras också.

Introduction

Influensa A-virus (IAV) är den prototypiska medlemmen i familjen Orthomyxoviridae och är känd för att orsaka globala epidemier och oförutsägbara pandemier. IAV orsakar mänsklig andningssjukdom, influensa, allmänt känd som “influensa”. Influensan är en akut sjukdom som resulterar i induktion av värdpro- och antiinflammatoriska medfödda immunsvar och död av epitelceller i människans luftvägar. Båda processerna styrs av ett fenomen som kallas programmerad celldöd1. Signaleringen för programmerad celldöd induceras så snart olika patogenigenkänningsreceptorer känner av de inkommande viruspartiklarna i värdceller. Detta leder till programmering av infekterade cellers död och signalering till de närliggande friska cellerna genom tre sammankopplade vägar som kallas pyroptos, apoptos och nekroptos – nyligen myntade som en process, PANoptosis1.

PANoptos involverar proteolytisk bearbetning av många värd- och virusproteiner från induktion till utförande. Sådan bearbetning av proteiner leds främst av en familj av cysteinproteaser som kallas caspaser 1,2. Upp till 18 caspaser (från caspase 1 till caspase 18) är kända3. De flesta caspaser uttrycks som pro-caspaser och aktiveras genom att genomgå sin egen proteolytiska bearbetning antingen genom autokatalys eller andra caspaser4 som svar på en stimulans som en virusinfektion. PANoptosen av IAV-infekterade celler ansågs vara en värdförsvarsmekanism, men IAV har utvecklat sätt att undvika och utnyttja den för att underlätta dess replikation 1,2,5,6. En av dem är att motverka värdfaktorerna via kaspasmedierad klyvning eller nedbrytning som antingen i sig är antivirala eller stör ett av stegen i IAV-livscykeln. För detta ändamål har värdfaktorer, kortatin, HDAC4 och HDAC6 upptäckts genomgå kaspasmedierad klyvning eller nedbrytning i IAV-infekterade epitelceller 7,8,9. HDAC4 och HDAC6 är anti-IAV-faktorer 8,10, och kortaktin stör IAV-replikation i ett senare infektionsstadium, potentiellt under viral montering och spirande 11.

Dessutom aktiveras olika caspaser, som i sin tur klyver flera proteiner för att aktivera värdens inflammatoriska svar under IAV-infektion 1,2. Vidare genomgår nukleoprotein (NP), jonkanal M2-protein av IAV 12,13,14 och olika proteiner från andra virus 3,15,16 också kaspasmedierad klyvning under infektion, vilket påverkar viral patogenes. Därför finns det ett kontinuerligt behov av att studera kaspasmedierad klyvning eller nedbrytning av värd- och virusproteiner under IAV och andra virusinfektioner för att förstå den molekylära grunden för viral patogenes. Häri presenteras metoderna för att (1) bedöma klyvningen eller nedbrytningen av sådana proteiner genom caspaser, (2) identifiera dessa caspaser och (3) lokalisera klyvningsställena.

Protocol

Myndighetsgodkännanden erhölls från University of Otago Institutional Biological Safety Committee för att arbeta med IAV- och däggdjursceller. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) eller humana lungalveolära epitelceller A549 och IAV H1N1-subtyper användes för denna studie. IAV odlades i kycklingägg, som beskrivs på andra ställen17. Sterila och aseptiska förhållanden användes för att arbeta med däggdjursceller, och en biosäkerhetsnivå 2 (eller fysisk inneslutning 2) och klass II bios?…

Representative Results

Behandling med caspase 3-hämmareDet har upptäckts att värdkortatin, HDAC4 och HDAC6 polypeptider genomgår nedbrytning som svar på IAV-infektion i både hund (MDCK) och humana (A549, NHBE) celler 7,8,9. Genom att använda ovanstående metoder avslöjades att IAV-inducerade värdkaspaser, särskilt caspase 3, orsakar deras nedbrytning 7,8,9.<sup c…

Discussion

Det är uppenbart att virus skräddarsyr värdfaktorerna och vägarna till deras fördel. I sin tur motstår värdcellerna det genom att använda olika strategier. En av dessa strategier är PANoptosis, som värdceller använder som en antiviral strategi mot virusinfektioner. Virus som IAV har dock utvecklat sina egna strategier för att motverka PANoptos och utnyttja det till sin fördel 1,3,6. Detta samspel involverar klyvning…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författaren erkänner Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice och Phyllis Paykel Trust (Nya Zeeland), H.S. och J.C. Anderson Trust (Dunedin) och Institutionen för mikrobiologi och immunologi och School of Biomedical Sciences (University of Otago).

Materials

A549 cells ATCC CRM-CCL-185 Human, epithelial, lung
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434
Caspase 3 Inhibitor Sigma-Aldrich 264156-M Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Goat anti-NP antibody Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 13778150
MDCK cells ATCC CCL-34 Dog, epithelial, kidney
MG132 Sigma-Aldrich M7449
Minimum Essential Medium (MEM) ThermoFisher Scientific 11095080 Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 Sigma-Aldrich SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2  LI-COR Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion  Addgene 50728 Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 Sigma-Aldrich NM_004346 siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 Sigma-Aldrich NM_001226 siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 Sigma-Aldrich NM_001227 siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs Sigma-Aldrich KSPQ12012 Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane Cytiva (Fomerly GE Healthcare) 10600003
Rabbit anti-actin antibody Abcam ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody Cell Signaling 3502
Rabbit anti-GFP antibody Takara 632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5625
Transfection medium, Opti-MEM ThermoFisher Scientific 11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 Merck
Trypsin, TPCK-Treated Sigma-Aldrich 4370285

Referências

  1. Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -. D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
  2. Zheng, M., Kanneganti, T. -. D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
  3. Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
  4. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
  5. Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
  6. Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
  7. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
  8. Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
  9. Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
  10. Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
  11. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
  12. Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
  13. Zhirnov, O. P., Klenk, H. -. D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
  14. Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
  15. Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
  16. Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
  17. Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
  18. Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
  19. Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
  20. Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
  21. Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
  22. Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, 160-164 (2004).
  23. Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
  24. Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, 290-297 (2015).
check_url/pt/64189?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Husain, M. Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection. J. Vis. Exp. (185), e64189, doi:10.3791/64189 (2022).

View Video