Influensa A-virus (IAV) -infektion aktiverar de caspaser som klyver värd- och virusproteiner, som i sin tur har pro- och antivirala funktioner. Genom att använda hämmare, RNA-interferens, platsriktad mutagenes och western blotting- och RT-qPCR-tekniker identifierades kaspaser i infekterade däggdjursceller som klyver värdkortaktin och histondeacetylaser.
Caspaser, en familj av cysteinproteaser, orkestrerar programmerad celldöd som svar på olika stimuli, inklusive mikrobiella infektioner. Ursprungligen beskrivet att inträffa genom apoptos, är programmerad celldöd nu känd för att omfatta tre sammankopplade vägar: pyroptos, apoptos och nekroptos, tillsammans myntade som en process, PANoptosis. Påverkan A-virusinfektion (IAV) inducerar PANoptos i däggdjursceller genom att inducera aktivering av olika caspaser, som i sin tur klyver olika värd- såväl som virala proteiner, vilket leder till processer som aktivering av värdens medfödda antivirala svar eller nedbrytning av antagonistiska värdproteiner. I detta avseende har kaspas-3-medierad klyvning av värdkortatin, histondeacetylas 4 (HDAC4) och histondeacetylas 6 (HDAC6) upptäckts i både djur- och humanepitelceller som svar på IAV-infektionen. För att demonstrera detta användes hämmare, RNA-interferens och platsriktad mutagenes, och därefter mättes klyvningen eller motståndet mot klyvning och återvinning av kortattin-, HDAC4- och HDAC6-polypeptider med western blotting. Dessa metoder, i kombination med RT-qPCR, bildar en enkel men effektiv strategi för att identifiera värden såväl som virala proteiner som genomgår kaspasmedierad klyvning under en infektion av IAV eller andra mänskliga och djurvirus. I detta protokoll utvecklas de representativa resultaten av denna strategi, och sätten att göra den mer effektiv diskuteras också.
Influensa A-virus (IAV) är den prototypiska medlemmen i familjen Orthomyxoviridae och är känd för att orsaka globala epidemier och oförutsägbara pandemier. IAV orsakar mänsklig andningssjukdom, influensa, allmänt känd som “influensa”. Influensan är en akut sjukdom som resulterar i induktion av värdpro- och antiinflammatoriska medfödda immunsvar och död av epitelceller i människans luftvägar. Båda processerna styrs av ett fenomen som kallas programmerad celldöd1. Signaleringen för programmerad celldöd induceras så snart olika patogenigenkänningsreceptorer känner av de inkommande viruspartiklarna i värdceller. Detta leder till programmering av infekterade cellers död och signalering till de närliggande friska cellerna genom tre sammankopplade vägar som kallas pyroptos, apoptos och nekroptos – nyligen myntade som en process, PANoptosis1.
PANoptos involverar proteolytisk bearbetning av många värd- och virusproteiner från induktion till utförande. Sådan bearbetning av proteiner leds främst av en familj av cysteinproteaser som kallas caspaser 1,2. Upp till 18 caspaser (från caspase 1 till caspase 18) är kända3. De flesta caspaser uttrycks som pro-caspaser och aktiveras genom att genomgå sin egen proteolytiska bearbetning antingen genom autokatalys eller andra caspaser4 som svar på en stimulans som en virusinfektion. PANoptosen av IAV-infekterade celler ansågs vara en värdförsvarsmekanism, men IAV har utvecklat sätt att undvika och utnyttja den för att underlätta dess replikation 1,2,5,6. En av dem är att motverka värdfaktorerna via kaspasmedierad klyvning eller nedbrytning som antingen i sig är antivirala eller stör ett av stegen i IAV-livscykeln. För detta ändamål har värdfaktorer, kortatin, HDAC4 och HDAC6 upptäckts genomgå kaspasmedierad klyvning eller nedbrytning i IAV-infekterade epitelceller 7,8,9. HDAC4 och HDAC6 är anti-IAV-faktorer 8,10, och kortaktin stör IAV-replikation i ett senare infektionsstadium, potentiellt under viral montering och spirande 11.
Dessutom aktiveras olika caspaser, som i sin tur klyver flera proteiner för att aktivera värdens inflammatoriska svar under IAV-infektion 1,2. Vidare genomgår nukleoprotein (NP), jonkanal M2-protein av IAV 12,13,14 och olika proteiner från andra virus 3,15,16 också kaspasmedierad klyvning under infektion, vilket påverkar viral patogenes. Därför finns det ett kontinuerligt behov av att studera kaspasmedierad klyvning eller nedbrytning av värd- och virusproteiner under IAV och andra virusinfektioner för att förstå den molekylära grunden för viral patogenes. Häri presenteras metoderna för att (1) bedöma klyvningen eller nedbrytningen av sådana proteiner genom caspaser, (2) identifiera dessa caspaser och (3) lokalisera klyvningsställena.
Det är uppenbart att virus skräddarsyr värdfaktorerna och vägarna till deras fördel. I sin tur motstår värdcellerna det genom att använda olika strategier. En av dessa strategier är PANoptosis, som värdceller använder som en antiviral strategi mot virusinfektioner. Virus som IAV har dock utvecklat sina egna strategier för att motverka PANoptos och utnyttja det till sin fördel 1,3,6. Detta samspel involverar klyvning…
The authors have nothing to disclose.
Författaren erkänner Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice och Phyllis Paykel Trust (Nya Zeeland), H.S. och J.C. Anderson Trust (Dunedin) och Institutionen för mikrobiologi och immunologi och School of Biomedical Sciences (University of Otago).
A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem' |
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |