Protokoll för CRISPR/Cas9 Mutagenes av den orientaliska bananflugan Bactrocera dorsalis
Summary
Detta dokument presenterar steg-för-steg-protokollen för CRISPR/Cas9-mutagenes av den orientaliska fruktflugan Bactrocera dorsalis. Detaljerade steg som tillhandahålls av detta standardiserade protokoll kommer att fungera som en användbar guide för att generera mutanta flugor för funktionella genstudier i B. dorsalis.
Abstract
Den orientaliska bananflugan, Bactrocera dorsalis, är en mycket invasiv och adaptiv skadedjursart som orsakar skador på citrusfrukter och över 150 andra fruktgrödor över hela världen. Eftersom vuxna fruktflugor har stor flygkapacitet och kvinnor lägger sina ägg under fruktskinnet, fungerar insekticider som kräver direktkontakt med skadedjuret vanligtvis dåligt i fältet. Med utvecklingen av molekylärbiologiska verktyg och sekvenseringsteknik med hög kapacitet försöker många forskare utveckla miljövänliga strategier för skadedjurshantering. Dessa inkluderar RNAi eller genredigeringsbaserade bekämpningsmedel som nedreglerar eller tystar gener (molekylära mål), såsom luktgener som är involverade i sökbeteende, i olika skadedjur. För att anpassa dessa strategier för orientalisk fruktflugekontroll behövs effektiva metoder för funktionell genforskning. Gener med kritiska funktioner i överlevnad och reproduktion av B. dorsalis fungerar som bra molekylära mål för gennedslag och / eller tystnad. CRISPR/Cas9-systemet är en pålitlig teknik som används för genredigering, särskilt hos insekter. Denna uppsats presenterar en systematisk metod för CRISPR/Cas9-mutagenes av B. dorsalis, inklusive design och syntes av guide-RNA, insamling av embryon, embryoinjektion, insektsuppfödning och mutantscreening. Dessa protokoll kommer att fungera som en användbar guide för att generera mutanta flugor för forskare som är intresserade av funktionella genstudier i B. dorsalis.
Introduction
Den orientaliska bananflugan, Bactrocera dorsalis , är en kosmopolitisk insektsskadeart som orsakar skador på över 150 arter av fruktgrödor, inklusive guava, mango, Eugenia spp., Surinam körsbär, citrus, loquat och papaya1. Skadorna som orsakats enbart i Guangdongprovinsen (Kina) uppskattas till över 200 miljoner yuan. Vuxna kvinnor sätter in sina ägg under huden av mogna eller mogna frukter, vilket orsakar förfall och abscission av frukten, vilket minskar fruktkvaliteten och det totala utbytet av grödan2. Eftersom vuxna fruktflugor har stor flygkapacitet och deras larver borrar in i frukthuden, fungerar insekticider som kräver direktkontakt med skadedjuret dåligt i fältet. Dessutom har den omfattande användningen av insekticider ökat resistensen hos B. dorsalis mot olika jordbrukskemikalier, vilket gör kontrollen av dessa skadliga skadedjur ännu svårare3. Därför behövs det ett desperat behov av att utveckla effektiva och miljövänliga strategier för skadedjursbekämpning.
Nyligen, med utvecklingen av molekylärbiologiska verktyg och sekvenseringsteknik med hög kapacitet, försöker forskare utveckla miljövänliga strategier för skadedjurshantering, såsom RNAi, som riktar sig mot funktionaliteten hos viktiga gener (molekylära mål) för olika skadedjur. Gener som är avgörande för skadegörarens överlevnad och reproduktion kan identifieras genom funktionella genstudier och fungerar vidare som potentiella molekylära mål för förbättring av specifikt riktade och miljövänliga verktyg för skadedjursbekämpning4. För att anpassa sådana strategier till orientalisk fruktflugekontroll behövs effektiva metoder för funktionell genforskning.
CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) endonukleassystemet upptäcktes ursprungligen i bakterier och arkéer och visade sig vara en adaptiv mekanism som är involverad i igenkänning och nedbrytning av främmande intracellulärt DNA, såsom det som infördes genom att infektera bakteriofager5. I CRISPR-systemet av typ II styrs Cas9-endonukleas av små associerade RNA (crRNA och tracrRNA) för att klyva intrångs-DNA 6,7,8 och har blivit ett av de mest använda verktygen för genredigering hittills9,10,11,12. Eftersom CRISPR/Cas9-systemet har flera fördelar, såsom hög effektivitet för gendämpning och låg kostnad, har det redan använts för genredigering i olika insektsarter, inklusive Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 och Bombyx mori16. I B. dorsalis har gener relaterade till kroppsfärg, vingdimorfism och könsbestämning framgångsrikt slagits ut med CRISPR/Cas917,18,19. Detaljerade procedurer för CRISPR/Cas9-applicering i denna insekt är dock fortfarande ofullständiga. Dessutom är vissa steg som tillhandahålls av forskare för B. dorsalis genredigering också varierade och i behov av standardisering. Till exempel var formerna av Cas9 olika i publicerade referenser17,18,19.
Detta dokument tillhandahåller en systematisk metod för mutagenes av B. dorsalis med hjälp av CRISPR / Cas9-systemet, inklusive design och syntes av guide-RNA, insamling av embryon, embryoinjektion, insektsuppfödning och mutantscreening. Detta protokoll kommer att fungera som en användbar guide för att generera mutanta flugor för forskare som är intresserade av funktionella genstudier i B. dorsalis.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9-systemet är det mest använda genredigeringsverktyget och har olika tillämpningar, såsom genförtunning30, grödavel 31 och grundläggande studier av genfuktioner32. Detta system har redan använts för genredigering hos olika insektsarter och har fungerat som ett effektivt verktyg för funktionella genstudier i skadedjur. De protokoll vi presenterar här standardiserar proceduren för design och syntes av guide-RNA, insamling av embry…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) och särskilda medel för vetenskapsteknologisk innovation och industriell utveckling av Shenzhen Dapeng New District (Bidrag nr PT202101-02).
Materials
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
Referências
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -. H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- . TransDecoder Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018)
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genética. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
