प्राथमिक और सुसंस्कृत कोशिकाओं से साइटोप्लाज्मिक और परमाणु लंबे आरएनए की तैयारी
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग करके परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों से आरएनए को अलग करने के लिए एक कुशल और लचीली विधि प्रदान करता है, और फिर क्यूपीसीआर का उपयोग करके मान्य करता है। यह प्रभावी रूप से अन्य आरएनए तैयारी किट के प्रतिस्थापन के रूप में कार्य करता है।
Abstract
इंट्रासेल्युलर घटकों का पृथक्करण अब कई वर्षों से सेलुलर जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण उपकरण रहा है और उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान करने में सक्षम है कि उनका स्थान उनके कार्य को कैसे प्रभावित कर सकता है। विशेष रूप से, परमाणु और साइटोप्लाज्मिक आरएनए का पृथक्करण कैंसर कोशिकाओं के संदर्भ में और दवाओं के लिए नए लक्ष्य खोजने की खोज में महत्वपूर्ण हो गया है। परमाणु-साइटोप्लाज्मिक आरएनए निष्कर्षण के लिए किट खरीदना महंगा हो सकता है जब कई आवश्यक सामग्री एक विशिष्ट प्रयोगशाला सेटिंग के भीतर पाई जा सकती है। वर्तमान विधि का उपयोग करते हुए, जो अधिक महंगी किट या अन्य समय लेने वाली प्रक्रियाओं को बदल सकता है, परमाणु और साइटोप्लाज्मिक आरएनए को अलग करने के लिए केवल एक होममेड लाइसिस बफर, एक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज और आरएनए अलगाव शुद्धिकरण कॉलम की आवश्यकता होती है। लाइसिस बफर का उपयोग परमाणु लिफाफे की अखंडता को प्रभावित किए बिना कोशिका की बाहरी झिल्ली को धीरे से लाइस करने के लिए किया जाता है, जिससे इसके इंट्रासेल्युलर घटकों को जारी करने की अनुमति मिलती है। फिर, नाभिक को एक साधारण सेंट्रीफ्यूजेशन चरण द्वारा अलग किया जा सकता है क्योंकि उनके पास लाइसिस समाधान की तुलना में उच्च घनत्व होता है। सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग इन क्षेत्रों को उनके घनत्व अंतर के आधार पर अलग करने के लिए किया जाता है ताकि नाभिक में उपकोशिकीय तत्वों को साइटोप्लाज्म से अलग किया जा सके। एक बार सेंट्रीफ्यूजेशन ने विभिन्न घटकों को अलग कर दिया है, तो आरएनए सामग्री को शुद्ध करने के लिए एक आरएनए क्लीन-अप किट का उपयोग किया जाता है, और क्यूपीसीआर को पृथक्करण गुणवत्ता को मान्य करने के लिए किया जाता है, जो विभिन्न अंशों में परमाणु और साइटोप्लाज्मिक आरएनए की मात्रा से निर्धारित होता है। प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता को दर्शाते हुए, अलगाव के सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण स्तर हासिल किए गए थे। इसके अलावा, इस प्रणाली को विभिन्न प्रकार के आरएनए (कुल, छोटे आरएनए, आदि) के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जो साइटोप्लाज्म-न्यूक्लियस इंटरैक्शन के लक्षित अध्ययन की अनुमति देता है, और नाभिक और साइटोप्लाज्म में रहने वाले आरएनए के कार्य में अंतर को समझने में सहायता करता है।
Introduction
उपकोशिकीय घटकों में सेलुलर फ्रैक्शनेशन विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं के स्थानीयकरण को निर्धारित करने में परिभाषित जैव रासायनिक डोमेन और एड्स के अलगाव और अध्ययन की अनुमति देता है और यह उनके कार्यको कैसे प्रभावित कर सकता है। विभिन्न इंट्रासेल्युलर स्थानों से आरएनए का अलगाव प्रतिलेखन स्तर की घटनाओं और नाभिक और साइटोप्लाज्म के बीच अन्य इंटरैक्शन के आनुवंशिक और जैव रासायनिक विश्लेषण की बेहतर सटीकता के लिए अनुमति दे सकता है, जो वर्तमान प्रोटोकॉल2 के प्राथमिक उद्देश्य के रूप में कार्य करता है। यह प्रोटोकॉल परमाणु निर्यात में उनकी संबंधित भूमिकाओं को निर्धारित करने के लिए साइटोप्लाज्मिक और परमाणु आरएनए के अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए विकसित किया गया था और यह समझने के लिए कि नाभिक और साइटोप्लाज्म में आरएनए का उपकोशिकीय स्थानीयकरण सेलुलर प्रक्रियाओं में उनके कार्य को कैसे प्रभावित कर सकता है। एक विशिष्ट प्रयोगशाला सेटिंग से सामग्री का उपयोग करके, परिणामों की गुणवत्ता को खतरे में डाले बिना पहले से स्थापित प्रोटोकॉल की तुलना में परमाणु और साइटोप्लाज्मिक फ्रैक्शनेशन को अधिक प्रभावी ढंग से और कम खर्चीला प्राप्त करना संभव था।
इसके अतिरिक्त, साइटोप्लाज्म और नाभिक के बीच अणुओं के आदान-प्रदान का अध्ययन सीधे इन क्षेत्रों को अलग करके किया जा सकता है। अधिक विशेष रूप से, ट्रांसस्क्रिप्टम को समझना विकास और बीमारी को समझने के लिए आवश्यक है। हालांकि, आरएनए किसी भी समय अलग-अलग परिपक्वता स्तरों पर हो सकते हैं और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को जटिल कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल परमाणु और साइटोप्लाज्मिक उपकोशिकीय अंशों से आरएनए को अलग करने की क्षमता की अनुमति देता है, जो आरएनए के अध्ययन में सहायता कर सकता है और रुचि के एक विशेष आरएनए की बेहतर समझ के लिए अनुमति दे सकता है, जैसे कि गैर-कोडिंग आरएनए का स्थानीयकरण या नाभिक के भीतर स्प्लिस जंक्शनों का विश्लेषण।
इस प्रोटोकॉल को साइटोप्लाज्मिक और परमाणु लंबे आरएनए को अलग करने के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें एमआरएनए, आरआरएनए और लंबे गैर-कोडिंग आरएनए (एलएनसीआरएनए) शामिल हैं, क्योंकि उपयोग किए गए आरएनए शुद्धि करण कॉलम की आकार चयनात्मकता है, जिसे रुचि के अन्य आरएनए को अलग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इससे पहले, एमआरएनए और एलएनसीआरएनए जैसे लंबे आरएनए का कार्य, सेल 4,5 के भीतर उनके संबंधित स्थानीयकरण पर अत्यधिक निर्भर करता था। इसलिए, नाभिक से उपकोशिकीय डोमेन में निर्यात का अध्ययन उस भूमिका को समझने की दिशा में अधिक लक्षित हो गया है जो आरएनए या अन्य सेलुलर घटकों का निर्यात सेल पर हो सकता है। एलएनसीआरएनए इसके एक प्रमुख उदाहरण के रूप में काम करते हैं, क्योंकि उनका अनुवाद और बाद के प्रभाव काफी हद तक आरएनए6 के अन्य रूपों के साथ निकटता और बातचीत पर निर्भर करते हैं। इसके अलावा, परमाणु और साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रों के बीच सेलुलर तत्वों का आदान-प्रदान विभिन्न कैंसरउपचारों के प्रतिरोध तंत्र से जुड़ा हुआ है। इंट्रासेल्युलर डिब्बों के अलगाव ने परमाणु निर्यात अवरोधकों के विकास की अनुमति दी है, जिसने विभिन्न उपचारों के प्रतिरोध तंत्र के प्रभाव को कम कर दियाहै।
परमाणु और साइटोप्लाज्मिक आरएनए को अलग करने के बाद, रुचि के आरएनए को शुद्ध करने के लिए चरण किए जाते हैं। चूंकि आरएनए शुद्धिकरण किट आमतौर पर प्रयोगशालाओं के भीतर पाए जाते हैं और लंबे आरएनए को शुद्ध करने और अलग करने के लिए कार्य करते हैं, इसलिए वे इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य को अच्छी तरह से पूरा करते हैं। आरएनए शुद्धिकरण के लिए, 1.8 से अधिक 260: 280 अनुपात उत्पन्न करना आरएनए अनुक्रमण या अन्य समान प्रक्रियाओं के लिए नमूनों की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें उच्च स्तर की शुद्धता और अलगाव की आवश्यकता होती है। अनियमित 260: 280 मान फिनोल संदूषण का संकेत देते हैं, खराब अलगाव का प्रदर्शन करते हैं और गलत परिणाम देतेहैं।
एक बार जब आरएनए शुद्धिकरण पूरा हो जाता है और 260: 280 मान एक स्वीकार्य सीमा से ऊपर होने की पुष्टि की जाती है, तो क्यूपीसीआर का उपयोग परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों के अलगाव परिणामों को मान्य करने के लिए किया गया था। ऐसा करने में, परमाणु और साइटोप्लाज्मिक फ्रैक्शनेशन स्तरों को प्रदर्शित करने के लिए रुचि के क्षेत्र के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, एमएएलएटी 1 और टीयूजी 1 का उपयोग क्रमशः परमाणु और साइटोप्लाज्मिकमार्करों के रूप में किया गया था। साथ में, वे एमएएलटी 1 के साथ परमाणु विभाजन के उच्च स्तर के प्रदर्शन की अनुमति देते हैं, जबकि साइटोप्लाज्मिक फ्रैक्शनेशन कम होने की उम्मीद है। इसके विपरीत, जब टीयूजी 1 का उपयोग किया जाता है, तो साइटोप्लाज्मिक फ्रैक्शनेशन का स्तर परमाणु विभाजन स्तरों से अधिक होने की उम्मीद है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, सेल के भीतर कार्रवाई की स्थिति के आधार पर आरएनए को अलग करना संभव था। इस प्रयोग के दौरान कई सामग्रियों तक व्यापक पहुंच और केवल लाइसिस बफर और घनत्व-आधारित सेंट्रीफ्यूजेशन तकनीकों के उपयोग के कारण, अन्य आरएनए प्रकारों और अन्य सेलुलर घटकों के लिए प्रयोज्यता व्यापक है। यह स्थान-विशिष्ट अभिव्यक्ति घटनाओं पर प्रकाश डालकर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है जो अन्यथा अलगाव के बिना अप्रभेद्य होंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के दौरान, रुचि की सेल लाइन के लिए सबसे प्रभावी तत्वों को अनुकूलित करने के लिए कुछ कदम उठाए गए थे। जबकि प्रोटोकॉल के भीतर कदम अपेक्षाकृत सरल हैं, प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलुओं के दौरान विश्ल?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अमेरिकन सोसाइटी ऑफ हेमेटोलॉजी, रॉबर्ट वुड जॉनसन फाउंडेशन, डोरिस ड्यूक चैरिटेबल फाउंडेशन, एडवर्ड पी इवांस फाउंडेशन और नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट (1K08CA230319) से अनुदान द्वारा समर्थित।
Materials
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
Referências
- Conrad, T., Orom, U. A. Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA. Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).
- Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. RNA localization in development. Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).
- Liu, X., Fagotto, F. A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells. Science Signaling. 4 (203), (2011).
- Jansen, R. P. mRNA localization: message on the move. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).
- Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization. Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).
- Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. 150 years of the mass action law. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012 (2015).
- El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy. Cancers (Basel). 8 (3), 35 (2016).
- Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer). Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).
- Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting. Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
- Taylor, J., et al. Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis. Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).
- Ayupe, A. C., et al. Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome. RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).
- Ghuysen, J. -. M., Hakenbeck, R. . Bacterial Cell Wall. , (1994).
- Fersht, A. . Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).
- Green, M. R., Sambrook, J. . How to win the battle with RNase. 2019 (2), (2019).
- Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).
- Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. , (2006).
- Taylor, J., et al. Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents. Blood. 132, 233 (2018).
