Fremstilling av cytoplasmatiske og nukleære lange RNA fra primære og dyrkede celler

Summary

Den nåværende protokollen tilbyr en effektiv og fleksibel metode for å isolere RNA fra nukleære og cytoplasmatiske fraksjoner ved bruk av dyrkede celler, og deretter validere ved hjelp av qPCR. Dette fungerer effektivt som en erstatning for andre RNA-forberedelsessett.

Abstract

Separasjonen av intracellulære komponenter har vært et sentralt verktøy i cellebiologi i mange år nå, og har vært i stand til å gi nyttig innsikt i hvordan deres plassering kan påvirke deres funksjon. Spesielt har separasjonen av nukleært og cytoplasmatisk RNA blitt viktig i sammenheng med kreftceller og søken etter å finne nye mål for medisiner. Innkjøpssett for kjernefysisk-cytoplasmatisk RNA-ekstraksjon kan være kostbart når mange av de nødvendige materialene finnes i en typisk laboratorieinnstilling. Ved å bruke den nåværende metoden, som kan erstatte dyrere sett eller andre tidkrevende prosesser, er det bare nødvendig med en hjemmelaget lysisbuffer, en stasjonær sentrifuge og RNA-isolasjonsrensingskolonner for å isolere nukleært og cytoplasmatisk RNA. Lysisbuffer brukes til å forsiktig lyse cellens ytre membran uten å påvirke integriteten til den nukleære konvolutten, noe som gjør det mulig å frigjøre sine intracellulære komponenter. Deretter kan kjernene isoleres ved et enkelt sentrifugeringstrinn siden de har en høyere tetthet enn lysisløsningen. Sentrifugering benyttes til å skille disse områdene basert på deres tetthetsforskjeller for å isolere subcellulære elementer i kjernen fra de i cytoplasma. Når sentrifugeringen har isolert de forskjellige komponentene, brukes et RNA-oppryddingssett for å rense RNA-innholdet, og qPCR utføres for å validere separasjonskvaliteten, kvantifisert av mengden nukleært og cytoplasmatisk RNA i de forskjellige fraksjonene. Statistisk signifikante nivåer av separasjon ble oppnådd, noe som illustrerer protokollens effektivitet. I tillegg kan dette systemet tilpasses for isolering av forskjellige typer RNA (totalt, lite RNA, etc.), noe som muliggjør målrettet studie av cytoplasma-kjerneinteraksjoner, og hjelpemidler til å forstå forskjellene i funksjonen til RNA som ligger i kjernen og cytoplasma.

Introduction

Cellulær fraksjonering i subcellulære komponenter muliggjør isolering og studier av definerte biokjemiske domener og hjelpemidler for å bestemme lokaliseringen av spesifikke cellulære prosesser og hvordan dette kan påvirke deres funksjon¹. Isolering av RNA fra forskjellige intracellulære steder kan muliggjøre forbedret nøyaktighet av genetisk og biokjemisk analyse av transkripsjonsnivåhendelser og andre interaksjoner mellom kjernen og cytoplasma, som tjener som hovedformålet med gjeldende protokoll². Denne protokollen ble utviklet for å sikre isolering av cytoplasmatiske og nukleære RNA for å bestemme deres respektive roller i kjernefysisk eksport og for å forstå hvordan subcellulær lokalisering av RNA i kjernen og cytoplasma kan påvirke deres funksjon i cellulære prosesser. Ved å bruke materialer fra en typisk laboratorieinnstilling var det mulig å oppnå nukleær og cytoplasmatisk fraksjonering mer effektivt og billigere enn tidligere etablerte protokoller uten å sette kvaliteten på resultatene i fare³.

I tillegg kan utvekslingen av molekyler mellom cytoplasma og kjernen studeres direkte ved å separere disse områdene. Mer spesifikt er forståelse av transkriptomet avgjørende for å forstå utvikling og sykdom. Imidlertid kan RNA være på forskjellige modningsnivåer til enhver tid og kan komplisere nedstrøms analyse. Denne protokollen tillater muligheten til å isolere RNA fra nukleære og cytoplasmatiske subcellulære fraksjoner, noe som kan hjelpe til med studier av RNA og muliggjøre en bedre forståelse av et bestemt RNA av interesse, for eksempel lokalisering av ikke-kodende RNA eller analyse av spleisekryss i kjernen.

Denne protokollen er optimalisert for å isolere cytoplasmatiske og nukleære lange RNAer, inkludert mRNAer, rRNA og lange ikke-kodende RNA (lncRNAer), på grunn av størrelsesselektiviteten til RNA-rensingskolonnen som brukes, som kan modifiseres for å isolere andre RNA av interesse. Tidligere var funksjonen til lange RNAer, som mRNA og lncRNA, sterkt avhengig av deres respektive lokalisering i cellen ^4,5. Derfor har studiet av eksporten fra kjernen til subcellulære domener blitt mer målrettet mot å forstå hvilken rolle eksport av RNA eller andre cellulære komponenter kan ha på cellen. lncRNA tjener som et godt eksempel på dette, da deres oversettelse og påfølgende effekter i stor grad er avhengige av nærhet og interaksjoner med andre former for RNA⁶. Videre er utveksling av cellulære elementer mellom nukleære og cytoplasmatiske regioner knyttet til resistensmekanismer mot ulike kreftbehandlinger⁷. Isoleringen av intracellulære rom har gjort det mulig å utvikle kjernefysiske eksporthemmere, noe som har redusert effekten av resistensmekanismer mot forskjellige terapier⁸.

Etter separering av nukleært og cytoplasmatisk RNA utføres trinn for å rense RNA av interesse. Siden RNA-rensesett ofte finnes i laboratorier og fungerer for å rense og isolere lange RNA, tjener de formålet med denne protokollen godt. For RNA-rensing er generering av 260: 280-forhold større enn 1,8 avgjørende for å sikre kvaliteten på prøver for RNA-sekvensering eller andre lignende prosedyrer som krever høye nivåer av renhet og isolasjon. Uregelmessige 260:280-verdier indikerer fenolforurensning, noe som viser dårlig isolasjon og gir unøyaktige resultater⁹.

Når RNA-rensingen er fullført og 260:280-verdiene er bekreftet å være over et akseptabelt område, ble qPCR brukt til å validere isolasjonsresultatene av nukleære og cytoplasmatiske fraksjoner. Ved å gjøre dette ble primere som var spesifikke for interesseområdet brukt til å demonstrere nukleære og cytoplasmatiske fraksjoneringsnivåer. I denne protokollen ble MALAT1 og TUG1 brukt som henholdsvis nukleære og cytoplasmatiske markører¹⁰. Sammen tillater de demonstrasjon av høye nivåer av nukleær fraksjonering med MALAT1, mens cytoplasmatisk fraksjonering forventes å være lav. Omvendt, når TUG1 brukes, forventes cytoplasmatiske fraksjoneringsnivåer å være høyere enn nukleære fraksjoneringsnivåer.

Ved hjelp av denne protokollen var det mulig å isolere RNA basert på deres virkningsposisjon i cellen. På grunn av utbredt tilgang til mange materialer og utnyttelse av bare lysisbuffer og tetthetsbaserte sentrifugeringsteknikker under dette eksperimentet, er anvendelighet for andre RNA-typer og andre cellulære komponenter utbredt. Dette kan gi viktig informasjon ved å belyse stedsspesifikke uttrykkshendelser som ellers ikke ville kunne skilles uten separasjon.

Protocol

K562-celler brukes til denne studien. Denne protokollen er optimalisert for å fungere for 1 x 10 6-5 x 106 millioner celler. Prosedyren kan imidlertid skaleres opp for større cellemengder ved å øke volumene på riktig måte. 1. Klargjøring av 0,25x lysebuffer Klargjør 0,25x lysebuffer ved å blande følgende komponenter i tabell 1A.MERK: Prøver krever ca. 300 μL 0,25x lysebuffer. Anbefalt volum = antall prøver x 300…

Representative Results

For å sikre at nukleær og cytoplasmatisk isolasjon var oppnådd, ble det utført en qPCR for å validere resultatene. Ved å gjøre dette ble primere som var spesifikke for interesseområdet benyttet for å demonstrere nukleære og cytoplasmatiske fraksjoneringsnivåer. I denne studien ble MALAT1 og TUG1 brukt som henholdsvis nukleære og cytoplasmatiske primere. Sammen tillater de demonstrasjon av høye nivåer av nukleær fraksjonering med MALAT1 som en positiv kontroll for nukleære elementer, mens cytoplasmatisk fr…

Discussion

Gjennom protokollen ble det tatt noen skritt for å optimalisere elementene for å være mest effektive for cellelinjen av interesse. Selv om trinnene i protokollen er relativt enkle, kan analyse og mindre justeringer under kritiske aspekter av protokollen være nødvendig. Det mest kritiske trinnet i protokollen er å endre konsentrasjonen av lysisbufferen til en riktig konsentrasjon basert på cellelinjen av interesse og det cellulære målet. Siden utnyttelsen av lysisbuffer i stor grad avhenger av forstyrrelsen av ce…

Materials

Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.