Herstellung von zytoplasmatischen und nukleären langen RNAs aus primären und kultivierten Zellen

Summary

Das vorliegende Protokoll bietet eine effiziente und flexible Methode, um RNA aus nukleären und zytoplasmatischen Fraktionen unter Verwendung kultivierter Zellen zu isolieren und dann mittels qPCR zu validieren. Dies dient effektiv als Ersatz für andere RNA-Präparationskits.

Abstract

Die Trennung intrazellulärer Komponenten ist seit vielen Jahren ein Schlüsselwerkzeug in der Zellbiologie und konnte nützliche Erkenntnisse darüber liefern, wie sich ihre Lage auf ihre Funktion auswirken kann. Insbesondere die Trennung von nukleärer und zytoplasmatischer RNA ist im Zusammenhang mit Krebszellen und der Suche nach neuen Angriffspunkten für Medikamente wichtig geworden. Der Kauf von Kits für die nukleär-zytoplasmatische RNA-Extraktion kann kostspielig sein, wenn viele der benötigten Materialien in einer typischen Laborumgebung gefunden werden können. Mit dem vorliegenden Verfahren, das teurere Kits oder andere zeitaufwändige Prozesse ersetzen kann, werden nur ein hausgemachter Lysepuffer, eine Tischzentrifuge und RNA-Isolationsreinigungssäulen benötigt, um nukleare und zytoplasmatische RNA zu isolieren. Lysepuffer wird verwendet, um die äußere Membran der Zelle sanft zu lysieren, ohne die Integrität der Kernhülle zu beeinträchtigen, wodurch ihre intrazellulären Komponenten freigesetzt werden können. Dann können die Kerne durch einen einfachen Zentrifugationsschritt isoliert werden, da sie eine höhere Dichte als die Lyselösung besitzen. Zentrifugation wird verwendet, um diese Bereiche basierend auf ihren Dichteunterschieden zu trennen, um subzelluläre Elemente im Zellkern von denen im Zytoplasma zu isolieren. Sobald die Zentrifugation die verschiedenen Komponenten isoliert hat, wird ein RNA-Clean-up-Kit verwendet, um den RNA-Gehalt zu reinigen, und es wird eine qPCR durchgeführt, um die Trennqualität zu validieren, die durch die Menge an nukleärer und zytoplasmatischer RNA in den verschiedenen Fraktionen quantifiziert wird. Es wurden statistisch signifikante Trennungsgrade erreicht, was die Wirksamkeit des Protokolls verdeutlicht. Darüber hinaus kann dieses System für die Isolierung verschiedener RNA-Typen (Gesamt-, Klein-RNA usw.) angepasst werden, was eine gezielte Untersuchung von Zytoplasma-Kern-Wechselwirkungen ermöglicht und zum Verständnis der Unterschiede in der Funktion von RNA beiträgt, die sich im Zellkern und im Zytoplasma befindet.

Introduction

Die zelluläre Fraktionierung in subzelluläre Komponenten ermöglicht die Isolierung und Untersuchung definierter biochemischer Domänen und hilft bei der Bestimmung der Lokalisierung spezifischer zellulärer Prozesse und wie sich dies auf ihre Funktion auswirken kann¹. Die Isolierung von RNA an verschiedenen intrazellulären Stellen kann eine verbesserte Genauigkeit der genetischen und biochemischen Analyse von Ereignissen auf Transkriptionsebene und anderen Wechselwirkungen zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma ermöglichen, was als Hauptzweck des aktuellen Protokolls² dient. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Isolierung von zytoplasmatischen und nukleären RNAs sicherzustellen, um ihre jeweilige Rolle beim Kernexport zu bestimmen und zu verstehen, wie die subzelluläre Lokalisation von RNAs im Zellkern und im Zytoplasma ihre Funktion in zellulären Prozessen beeinflussen kann. Durch die Verwendung von Materialien aus einer typischen Laborumgebung war es möglich, eine nukleare und zytoplasmatische Fraktionierung effektiver und kostengünstiger als bisher etablierte Protokolle zu erreichen, ohne die Qualität der Ergebnisse zu gefährden³.

Darüber hinaus kann der Austausch von Molekülen zwischen dem Zytoplasma und dem Zellkern direkt untersucht werden, indem diese Regionen getrennt werden. Genauer gesagt ist das Verständnis des Transkriptoms für das Verständnis von Entwicklung und Krankheit unerlässlich. RNAs können sich jedoch zu einem bestimmten Zeitpunkt in unterschiedlichen Reifegraden befinden und die nachgelagerte Analyse erschweren. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von RNA aus nukleären und zytoplasmatischen subzellulären Fraktionen, was bei RNA-Studien hilfreich sein und ein besseres Verständnis einer bestimmten RNA von Interesse ermöglichen kann, wie z. B. die Lokalisierung nicht-kodierender RNAs oder die Analyse von Spleißverbindungen innerhalb des Zellkerns.

Dieses Protokoll wurde für die Isolierung zytoplasmatischer und nukleärer langer RNAs, einschließlich mRNAs, rRNAs und langer nicht-kodierender RNAs (lncRNAs), aufgrund der Größenselektivität der verwendeten RNA-Aufreinigungssäule optimiert, die modifiziert werden kann, um andere RNAs von Interesse zu isolieren. Bisher hing die Funktion langer RNAs, wie mRNAs und lncRNAs, stark von ihrer jeweiligen Lokalisation innerhalb der Zelle^{ab 4,5}. Daher ist die Untersuchung des Exports vom Zellkern in subzelluläre Domänen gezielter geworden, um die Rolle zu verstehen, die der Export von RNA oder anderen zellulären Komponenten auf die Zelle haben kann. lncRNAs dienen als Paradebeispiel dafür, da ihre Translation und ihre nachfolgenden Effekte weitgehend von der Nähe und den Wechselwirkungen mit anderen Formen von RNA⁶ abhängen. Darüber hinaus ist der Austausch zellulärer Elemente zwischen nukleären und zytoplasmatischen Regionen mit Resistenzmechanismen gegen verschiedene Krebsbehandlungen verbunden⁷. Die Isolierung intrazellulärer Kompartimente hat die Entwicklung von Kernexportinhibitoren ermöglicht, was die Auswirkungen von Resistenzmechanismen gegen verschiedene Therapien verringert hat⁸.

Nach der Trennung von nukleärer und zytoplasmatischer RNA werden Schritte durchgeführt, um die interessierende RNA zu reinigen. Da RNA-Aufreinigungskits häufig in Laboratorien zu finden sind und lange RNAs reinigen und isolieren, erfüllen sie den Zweck dieses Protokolls gut. Für die RNA-Aufreinigung ist die Erzeugung eines Verhältnisses von 260:280 von mehr als 1,8 entscheidend, um die Qualität der Proben für die RNA-Sequenzierung oder andere ähnliche Verfahren zu gewährleisten, die ein hohes Maß an Reinheit und Isolierung erfordern. Unregelmäßige Werte von 260:280 deuten auf eine Phenolkontamination hin, was auf eine schlechte Isolierung hinweist und zu ungenauen Ergebnissen führt⁹.

Sobald die RNA-Aufreinigung abgeschlossen ist und bestätigt wurde, dass die 260:280-Werte über einem akzeptablen Bereich liegen, wurde die qPCR verwendet, um die Isolationsergebnisse von Kern- und zytoplasmatischen Fraktionen zu validieren. Dabei wurden Primer verwendet, die für die interessierende Region spezifisch sind, um die nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus zu demonstrieren. In diesem Protokoll wurden MALAT1 und TUG1 als nukleäre bzw. zytoplasmatische Marker verwendet¹⁰. Zusammen ermöglichen sie den Nachweis einer hohen Kernfraktionierung mit MALAT1, während eine zytoplasmatische Fraktionierung voraussichtlich gering ist. Umgekehrt wird bei Verwendung von TUG1 erwartet, dass die zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus höher sind als die Kernfraktionierungsniveaus.

Mit Hilfe dieses Protokolls war es möglich, RNAs basierend auf ihrer Wirkungsposition innerhalb der Zelle zu isolieren. Aufgrund des weit verbreiteten Zugangs zu vielen Materialien und der Verwendung von nur Lysepuffer- und dichtebasierten Zentrifugationstechniken während dieses Experiments ist die Anwendbarkeit auf andere RNA-Typen und andere zelluläre Komponenten weit verbreitet. Dies kann wichtige Informationen liefern, indem standortspezifische Ausdrucksereignisse beleuchtet werden, die sonst ohne Trennung nicht zu unterscheiden wären.

Protocol

Für die vorliegende Studie werden K562-Zellen verwendet. Dieses Protokoll wurde für 1 x 10,6-5 x 10,6 Millionen Zellen optimiert. Das Verfahren kann jedoch für größere Zellmengen skaliert werden, indem die Volumina entsprechend erhöht werden. 1. Herstellung des 0,25-fachen Lysepuffers Bereiten Sie 0,25-fachen Lysepuffer vor, indem Sie die folgenden Komponenten in Tabelle 1A mischen.HINWEIS: Für die Proben werden ca. 3…

Representative Results

Um sicherzustellen, dass eine nukleare und zytoplasmatische Isolierung erreicht wurde, wurde eine qPCR durchgeführt, um die Ergebnisse zu validieren. Dabei wurden Primer verwendet, die für die interessierende Region spezifisch sind, um die nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus zu demonstrieren. In dieser Studie wurden MALAT1 und TUG1 als nukleäre bzw. zytoplasmatische Primer verwendet. Zusammen ermöglichen sie den Nachweis eines hohen Niveaus der Kernfraktionierung mit MALAT1 als Positivkontrolle fü…

Discussion

Während des gesamten Protokolls wurden einige Schritte unternommen, um die Elemente so zu optimieren, dass sie für die interessierende Zelllinie am effektivsten sind. Während die Schritte innerhalb des Protokolls relativ einfach sind, können Analysen und kleinere Anpassungen bei kritischen Aspekten des Protokolls erforderlich sein. Der kritischste Schritt im Protokoll besteht darin, die Konzentration des Lysepuffers auf eine geeignete Konzentration zu ändern, die auf der interessierenden Zelllinie und dem zelluläre…

Materials

Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.