Preparazione di RNA lunghi citoplasmatici e nucleari da cellule primarie e in coltura

Summary

Il presente protocollo offre un metodo efficiente e flessibile per isolare l’RNA da frazioni nucleari e citoplasmatiche utilizzando cellule in coltura e quindi convalidare utilizzando qPCR. Questo serve efficacemente come sostituto per altri kit di preparazione dell’RNA.

Abstract

La separazione dei componenti intracellulari è stata uno strumento chiave nella biologia cellulare per molti anni ed è stata in grado di fornire informazioni utili su come la loro posizione può influire sulla loro funzione. In particolare, la separazione dell’RNA nucleare e citoplasmatico è diventata importante nel contesto delle cellule tumorali e nella ricerca di nuovi bersagli per i farmaci. L’acquisto di kit per l’estrazione dell’RNA nucleare-citoplasmatico può essere costoso quando molti dei materiali richiesti possono essere trovati all’interno di un tipico ambiente di laboratorio. Utilizzando il metodo attuale, che può sostituire kit più costosi o altri processi che richiedono tempo, sono necessari solo un tampone di lisi fatto in casa, una centrifuga da banco e colonne di purificazione dell’isolamento dell’RNA per isolare l’RNA nucleare e citoplasmatico. Il tampone di lisi viene utilizzato per lisare delicatamente la membrana esterna della cellula senza compromettere l’integrità dell’involucro nucleare, consentendo il rilascio dei suoi componenti intracellulari. Quindi, i nuclei possono essere isolati con una semplice fase di centrifugazione poiché possiedono una densità maggiore rispetto alla soluzione di lisi. La centrifugazione viene utilizzata per separare queste aree in base alle loro differenze di densità per isolare gli elementi subcellulari nel nucleo da quelli nel citoplasma. Una volta che la centrifugazione ha isolato i diversi componenti, viene utilizzato un kit di pulizia dell’RNA per purificare il contenuto di RNA e viene eseguita la qPCR per convalidare la qualità della separazione, quantificata dalla quantità di RNA nucleare e citoplasmatico nelle diverse frazioni. Sono stati raggiunti livelli di separazione statisticamente significativi, che illustrano l’efficacia del protocollo. Inoltre, questo sistema può essere adattato per l’isolamento di diversi tipi di RNA (RNA totale, piccolo, ecc.), Il che consente uno studio mirato delle interazioni citoplasma-nucleo e aiuta a comprendere le differenze nella funzione dell’RNA che risiedono nel nucleo e nel citoplasma.

Introduction

Il frazionamento cellulare in componenti subcellulari consente l’isolamento e lo studio di domini biochimici definiti e aiuta a determinare la localizzazione di specifici processi cellulari e come questo può influire sulla loro funzione¹. L’isolamento dell’RNA da diverse posizioni intracellulari può consentire una migliore accuratezza dell’analisi genetica e biochimica degli eventi a livello di trascrizione e di altre interazioni tra il nucleo e il citoplasma, che funge da scopo primario dell’attuale protocollo². Questo protocollo è stato sviluppato per garantire l’isolamento degli RNA citoplasmatici e nucleari per determinare i loro rispettivi ruoli nell’esportazione nucleare e per capire come la localizzazione subcellulare degli RNA nel nucleo e nel citoplasma possa influire sulla loro funzione nei processi cellulari. Utilizzando materiali provenienti da un tipico ambiente di laboratorio, è stato possibile ottenere il frazionamento nucleare e citoplasmatico in modo più efficace e meno costoso rispetto ai protocolli precedentemente stabiliti senza compromettere la qualità dei risultati³.

Inoltre, lo scambio di molecole tra il citoplasma e il nucleo può essere studiato direttamente separando queste regioni. Più specificamente, la comprensione del trascrittoma è essenziale per comprendere lo sviluppo e la malattia. Tuttavia, gli RNA possono essere a diversi livelli di maturazione in un dato momento e possono complicare l’analisi a valle. Questo protocollo consente la capacità di isolare l’RNA da frazioni subcellulari nucleari e citoplasmatiche, che possono aiutare negli studi dell’RNA e consentire una migliore comprensione di un particolare RNA di interesse, come la localizzazione di RNA non codificanti o l’analisi delle giunzioni di giunzione all’interno del nucleo.

Questo protocollo è stato ottimizzato per isolare RNA lunghi citoplasmatici e nucleari, inclusi mRNA, rRNA e RNA lunghi non codificanti (lncRNA), a causa della selettività dimensionale della colonna di purificazione dell’RNA utilizzata, che può essere modificata per isolare altri RNA di interesse. In precedenza, la funzione degli RNA lunghi, come mRNA e lncRNA, dipendeva fortemente dalla loro rispettiva localizzazione all’interno della cellula ^4,5. Pertanto, lo studio dell’esportazione dal nucleo ai domini subcellulari è diventato più mirato verso la comprensione del ruolo che l’esportazione di RNA o altri componenti cellulari può avere sulla cellula. Gli lncRNA servono come primo esempio di questo, poiché la loro traduzione e i successivi effetti si basano in gran parte sulla vicinanza e sulle interazioni con altre forme di RNA⁶. Inoltre, lo scambio di elementi cellulari tra regioni nucleari e citoplasmatiche è legato a meccanismi di resistenza a vari trattamenti antitumorali⁷. L’isolamento dei compartimenti intracellulari ha permesso lo sviluppo di inibitori nucleari dell’esportazione, che ha ridotto gli effetti dei meccanismi di resistenza a diverse terapie⁸.

Dopo aver separato l’RNA nucleare e citoplasmatico, vengono eseguiti passaggi per purificare l’RNA di interesse. Poiché i kit di purificazione dell’RNA si trovano comunemente all’interno dei laboratori e funzionano per purificare e isolare gli RNA lunghi, servono bene allo scopo di questo protocollo. Per la purificazione dell’RNA, generare rapporti 260:280 superiori a 1,8 è fondamentale per garantire la qualità dei campioni per il sequenziamento dell’RNA o altre procedure simili che richiedono alti livelli di purezza e isolamento. Valori irregolari di 260:280 indicano contaminazione da fenolo, dimostrando uno scarso isolamento e producendo risultati imprecisi⁹.

Una volta completata la purificazione dell’RNA e confermati valori 260:280 al di sopra di un intervallo accettabile, la qPCR è stata utilizzata per convalidare i risultati di isolamento delle frazioni nucleari e citoplasmatiche. In tal modo, sono stati utilizzati primer specifici per la regione di interesse per dimostrare i livelli di frazionamento nucleare e citoplasmatico. In questo protocollo, MALAT1 e TUG1 sono stati utilizzati come marcatori nucleari e citoplasmatici, rispettivamente¹⁰. Insieme, consentono la dimostrazione di alti livelli di frazionamento nucleare con MALAT1, mentre il frazionamento citoplasmatico dovrebbe essere basso. Al contrario, quando viene utilizzato TUG1, i livelli di frazionamento citoplasmatico dovrebbero essere superiori ai livelli di frazionamento nucleare.

Utilizzando questo protocollo, è stato possibile isolare gli RNA in base alla loro posizione di azione all’interno della cellula. A causa dell’ampio accesso a molti materiali e dell’utilizzo del solo tampone di lisi e delle tecniche di centrifugazione basate sulla densità durante questo esperimento, l’applicabilità ad altri tipi di RNA e ad altri componenti cellulari è diffusa. Questo può fornire informazioni importanti facendo luce su eventi di espressione specifici della posizione che altrimenti sarebbero indistinguibili senza separazione.

Protocol

Le cellule K562 sono utilizzate per il presente studio. Questo protocollo è stato ottimizzato per funzionare per 1 x 10 6-5 x 106 milioni di celle. Tuttavia, la procedura può essere scalata per quantità di celle maggiori aumentando i volumi in modo appropriato. 1. Preparazione del tampone di lisi 0,25x Preparare un tampone di lisi 0,25x miscelando i seguenti componenti forniti nella Tabella 1A.NOTA: I campioni richiedono …

Representative Results

Per garantire che l’isolamento nucleare e citoplasmatico fosse stato raggiunto, è stata eseguita una qPCR per convalidare i risultati. In tal modo, sono stati utilizzati primer specifici per la regione di interesse per dimostrare i livelli di frazionamento nucleare e citoplasmatico. In questo studio, MALAT1 e TUG1 sono stati utilizzati rispettivamente come primer nucleari e citoplasmatici. Insieme, consentono la dimostrazione di alti livelli di frazionamento nucleare con MALAT1 come controllo positivo per gli elementi n…

Discussion

Durante tutto il protocollo, sono stati presi alcuni passaggi per ottimizzare gli elementi per essere più efficaci per la linea cellulare di interesse. Mentre i passaggi all’interno del protocollo sono relativamente semplici, possono essere necessarie analisi e piccoli aggiustamenti durante gli aspetti critici del protocollo. Il passo più critico nel protocollo è modificare la concentrazione del tampone di lisi in una concentrazione appropriata basata sulla linea cellulare di interesse e sul bersaglio cellulare. Poich…

Materials

Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.