일차 세포와 배양된 세포에서 세포질 및 핵 Long RNA의 제조
Summary
현재 프로토콜은 배양된 세포를 사용하여 핵 및 세포질 분획에서 RNA를 분리한 다음 qPCR을 사용하여 검증하는 효율적이고 유연한 방법을 제공합니다. 이것은 다른 RNA 준비 키트를 효과적으로 대체하는 역할을 합니다.
Abstract
세포 내 구성 요소의 분리는 수년 동안 세포 생물학의 핵심 도구였으며 그 위치가 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 유용한 통찰력을 제공할 수 있었습니다. 특히, 핵 및 세포질 RNA의 분리는 암세포와 약물의 새로운 표적을 찾는 맥락에서 중요해졌습니다. 핵-세포질 RNA 추출을 위한 키트를 구입하는 것은 일반적인 실험실 환경에서 필요한 많은 재료를 찾을 수 있는 경우 비용이 많이 들 수 있습니다. 더 비싼 키트나 기타 시간이 많이 소요되는 공정을 대체할 수 있는 본 방법을 사용하면 수제 용해 완충액, 벤치탑 원심분리기 및 RNA 분리 정제 컬럼만 있으면 핵 및 세포질 RNA를 분리할 수 있습니다. 용해 완충액은 핵막의 무결성에 영향을 미치지 않고 세포의 외막을 부드럽게 용해시켜 세포 내 구성 요소를 방출하는 데 사용됩니다. 그런 다음 핵은 용해 용액보다 높은 밀도를 갖기 때문에 간단한 원심분리 단계로 분리할 수 있습니다. 원심분리는 밀도 차이에 따라 이러한 영역을 분리하여 핵의 세포 내 요소를 세포질의 하위 요소와 분리하는 데 사용됩니다. 원심분리를 통해 서로 다른 성분이 분리되면 RNA clean-up kit를 사용하여 RNA 함량을 정제하고 qPCR을 수행하여 분리 품질을 검증하고 서로 다른 분획의 핵 및 세포질 RNA의 양으로 정량화합니다. 통계적으로 유의미한 수준의 분리가 달성되어 프로토콜의 효과를 보여줍니다. 또한, 이 시스템은 다양한 유형의 RNA(총, 작은 RNA 등)의 분리에 적용할 수 있어 세포질-핵 상호작용에 대한 표적 연구를 가능하게 하고 핵과 세포질에 존재하는 RNA의 기능 차이를 이해하는 데 도움이 됩니다.
Introduction
세포 내 구성 요소로의 세포 분획은 정의된 생화학적 영역의 분리 및 연구를 가능하게 하고 특정 세포 과정의 국소화와 이것이 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 결정하는 데 도움이 됩니다1. 상이한 세포내 위치로부터 RNA를 분리하면 전사 수준 사건 및 핵과 세포질 사이의 다른 상호작용에 대한 유전적 및 생화학적 분석의 정확성이 향상될 수 있으며, 이는 현재 프로토콜2의 주요 목적이다. 이 프로토콜은 세포질 및 핵 RNA의 분리를 보장하여 핵 수출에서 각각의 역할을 결정하고 핵 및 세포질에서 RNA의 세포 내 국소화가 세포 과정에서의 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하기 위해 개발되었습니다. 일반적인 실험실 환경의 재료를 사용하여 결과의 품질을 위태롭게 하지 않으면서 이전에 확립된 프로토콜보다 더 효과적이고 저렴하게 핵 및 세포질 분획을 달성할 수 있었습니다3.
또한 세포질과 핵 사이의 분자 교환은 이러한 영역을 분리하여 직접 연구할 수 있습니다. 보다 구체적으로, 전사체를 이해하는 것은 발달과 질병을 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 RNA는 주어진 시간에 다른 성숙 수준에 있을 수 있으며 다운스트림 분석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 이 프로토콜은 핵 및 세포질 세포 내 분획에서 RNA를 분리하는 기능을 허용하여 RNA 연구에 도움이 될 수 있으며 비암호화 RNA의 국소화 또는 핵 내 스플라이스 접합부 분석과 같은 관심 있는 특정 RNA에 대한 더 나은 이해를 가능하게 합니다.
이 프로토콜은 mRNA, rRNA 및 긴 비암호화 RNA(lncRNA)를 포함한 세포질 및 핵 긴 RNA를 분리하는 데 최적화되어 있으며, 이는 관심 있는 다른 RNA를 분리하도록 변형될 수 있는 활용된 RNA 정제 컬럼의 크기 선택성으로 인해 사용됩니다. 이전에는 mRNA 및 lncRNA와 같은 긴 RNA의 기능이 세포 내 각각의 국소화에 크게 의존했습니다 4,5. 따라서 핵에서 세포 내 영역으로의 수출에 대한 연구는 RNA 또는 기타 세포 구성 요소를 수출하는 것이 세포에서 가질 수 있는 역할을 이해하는 데 더 중점을 두게 되었습니다. lncRNA는 번역 및 후속 효과가 다른 형태의 RNA6과의 근접성 및 상호 작용에 크게 의존하기 때문에 이에 대한 대표적인 예입니다. 또한, 핵 영역과 세포질 영역 사이의 세포 요소 교환은 다양한 암 치료에 대한 내성 메커니즘과 관련이 있다7. 세포 내 구획의 분리는 핵 수출 억제제의 개발을 허용했으며, 이는 다른 치료법에 대한 내성 메커니즘의 효과를 감소시켰다8.
핵 및 세포질 RNA를 분리한 후 관심 RNA를 정제하는 단계를 수행합니다. RNA 정제 키트는 실험실에서 흔히 볼 수 있으며 긴 RNA를 정제하고 분리하는 기능을 하기 때문에 이 프로토콜의 목적에 잘 부합합니다. RNA 정제의 경우, 1.8보다 큰 260:280 비율을 생성하는 것은 RNA 염기서열 분석 또는 높은 수준의 순도와 분리가 필요한 기타 유사한 절차를 위한 샘플의 품질을 보장하는 데 매우 중요합니다. 불규칙한 260:280 값은 페놀 오염을 나타내며, 분리가 불량하고 부정확한 결과를 산출합니다9.
RNA 정제가 완료되고 260:280 값이 허용 범위 이상인 것으로 확인되면 qPCR을 사용하여 핵 및 세포질 분획의 분리 결과를 검증했습니다. 그렇게 함으로써, 관심 영역에 특이적인 프라이머를 사용하여 핵 및 세포질 분획 수준을 입증했습니다. 이 프로토콜에서, MALAT1 및 TUG1은 각각 핵 및 세포질 마커로서 사용되었다10. 함께, 그들은 MALAT1을 사용하여 높은 수준의 핵 분획을 입증할 수 있는 반면, 세포질 분획은 낮을 것으로 예상됩니다. 반대로, TUG1이 사용되는 경우, 세포질 분획 수준은 핵 분획 수준보다 높을 것으로 예상된다.
이 프로토콜을 사용하여 세포 내 작용 위치에 따라 RNA를 분리할 수 있었습니다. 이 실험 동안 많은 물질에 대한 광범위한 접근과 용해 완충액 및 밀도 기반 원심분리 기술의 활용으로 인해 다른 RNA 유형 및 기타 세포 구성 요소에 대한 적용 가능성이 널리 퍼져 있습니다. 이는 분리 없이는 구별할 수 없는 위치별 표현 이벤트를 조명하여 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 전반에 걸쳐, 관심 있는 세포주에 가장 효과적이도록 요소를 최적화하기 위한 몇 가지 단계가 취해졌다. 프로토콜 내의 단계는 비교적 간단하지만 프로토콜의 중요한 측면에서 분석 및 사소한 조정이 필요할 수 있습니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 용해 완충액의 농도를 관심 세포주와 세포 표적에 따라 적절한 농도로 수정하는 것입니다. 용해 완충액의 이용은 세포막의 파괴에 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
미국 혈액 학회, 로버트 우드 존슨 재단, 도리스 듀크 자선 재단, 에드워드 P. 에반스 재단 및 국립 암 연구소 (1K08CA230319)의 보조금 지원.
Materials
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
Referências
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